Studies on the pasteurella multocida, P-627 isolated from baikal teals (Anas formasa) in Korea : 국내 가창오리(Anasn formosa)에서 분리한 pasteurella multocida, P-627 균주에 대한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Fow 1 cholera (FC) is a contagious disease affecting domesticated and wild birds. It usually appears as a septicemic disease associated with high morbidity and mortality, but chronic or benign conditions occasionally occur.
In Korea, FC caused by Pasteurella multocida was firstly diagnosed in waterfow ls (Baikal teal;Anas formosa), which were submitted to National Veterinary Research & Quarantine Service in 2000. The total number of dead birds was high and estimated as 13,228, which was about 10% of total Baikal teal found around Cheonsoo bay, which is most famous place as habitat for Baikal teal around the world.
Although the clinical sings were limited because of sudden death, the gross lesions of dead Baikal teals were fairly specific and were multifocal necrotic foci in the liver with enlargement, petechial and/or ecchymotic hemorrhages on the epicardium, speenomegaly and presence of excess mucoid exudates in the mucosa of duodenum. These gross lesions were also similar to the histopathological lesions which were hepatocytic necrosis with intralesional becterial colonization, hemorrhage and necrosis in the heart, and hemorrhagic enteritis. P. multocida was isolated from the liver and heart of the birds submitted, and identified by biochemical and physiological properties including colonial morphology, gram staining, sugar fermentation and growth on MacConkey's agar. In the susceptibility to antibiotices, the isolates were susceptible to 20 different drugs except for gentamicin and kanamycin.
Based on the agar gel immunodiffusion test, the isolate P-627 of P. multocida was serologically identified as somatic serotype 1 X 12 X 14.
Author applied multiplex PCR assay to differentiate capsular serogroup A, B and D of P. multocidia, and each primer designed for a specific serogrouping yielded highly specific products for reference strains of serogroup A, B, and D, respectively. With the result, isolate P-627 was classified as capsular serogroup A, which was ubiquitous in the world, and predominated in avian hosts affected with FC. In specificity test, the pathogen was also differentiated from the bacteria commonly found in the chickens such as Escherichia coli, Salmonella pullorum, Riemerella anatipestifer, et al.
Fifty percent of mouse lethal dose (LD_50) value of the isolate P-627 was estimated as 1X10_05CFU. And the pathogenicity of the isolate for domestic poultry, including commercial layers, broiler breeders and ducks were examined. These birds were inoculated with ten-fold dilutions (from 10^6 to 10^1 CFU/01 ml) of the bacteria via the intramuscular(IM) and intratracheal(IT) route than those via IT route. Among domesticated fow ls, the highest susceptibility appeared in the commercial layers in which mortality rates were over 80%. In all dead birds, P. multocida was consistently isolated from the liver and spleen. This results demonstrated that the isolate has highly potential virulence for domesticated poultry.
The pathogenesis of fow 1 cholera in the chickens experimentally infected with isolate P-627 of P. multocida was also examined. The affected birds died without clinically specific signs from 24 to 96 hrs after inoculation. All dead birds had gross lesions of an acute hemorrhagic septicemia with petechial and/or ecchymotic hemorrhages on the epicardium and over alll serosal surfaces. Histopathologically, prominant vascular lesions and the extensive filorin exudations over parenchymatous organs caused by acute vascular damage were observed. The frequency of fibrinous thrombi, representing disseminated intravascular coagulopathy (DIC), were observed most highly in the lungs of all dead chickens, and followed by the spleen, liver, heart and duodenum which were major target organs.
For demonstration of P. multocida antigens in the tissuses, an immunoperoxidase technique based on the labelled avidin-biotin complex method was established. Immunoreactions were detected in the blood vessels of visceral organs, mucosae of digestive and respiratory tracts, and inflammatory cells at the times of 12 hrs to 96 hrs after inoculation.
To analyse the changes of trace mineral in the blood during acute phase of infection, the concentrations of iron, magnesium, potassium, magnesium, calcium and sodium were examined. Among them, iron concentrations were rapidly decreased between 24 hrs and 36 hrs after exposure. At these stage, the highest rate of bacterial reisolation also occurred in the blood.
The study results indicated that isolate P-627, first isolated from Baikal teals affected with FC in 2000, was typed as capsular A and somatic 1 X 12 X 14 serotype, and could be considered to be highly virulent for domesticated poultry. Also this study suggested that, in chickens, the bacteria could cause acute infection characterized by septicemia, with irreversible lesions occurring in the lungs, liver and spleen, eventually resulting in deadth caused by disseminated intravasoular coagulation(DIC) shock. For the control of the disease, however, will be needed to detect wild birds and mammals known to be latent carriers of P. multocida and to monitor the outbreak of FC in commercial poultry.

국문 초록 (Abstract)

가금콜레라는 농장에 사육하는 닭, 오리, 칠면조뿐만 아니라 야생조류에도 발병하는 세균성 전염병이다. 보통 급성의 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징적으로 나타나지만 만성 또는 경미한 증상만을 보이기도 한다.
겨울철 철새인 가창오리 (Baikel teal;학명:Anas Formosa) 에서 Pasteurella multocida 감염에 의한 가금콜레라 발생이 국내 처음으로 확인되었다. 본 질병으로 충청남도 서산시 천수만에서 월동하던 가창오리 약 10만수 중에 13,228수가 죽은 것으로 공식 확인되었다. 천수만은 시베리아에 날아온 가창오리가 국내에서 월동하는 가장 유명한 월동지로 알려진 곳이다. 가금콜레라로 죽은 가창 오리는 별 특이적인 임상증상을 보이지 않고 갑자기 폐사 되었으나 부검 결과 심하게 비대된 간장에서 다발성 흰색 괴사반점, 심외막내 점상 또는 반상 출혈점, 비장종대, 십이지장 내장내 점액성 삼출물 저류 등이 관찰되었다. 조직검사 결과 간장내 간세포괴사 및 세균 집락형성, 심장의 충·출혈과 근섬유 괴사, 출혈성 장염이 확인되었다. 죽은 가창오리의 간장과 심장에 분리한 세균을 집락 형태, 그람염색, oxidase 및 catalase 시험, MacConkey's agar, 운동성 검사 등을 통하여 최종 Pasteurella multocida 로 동정되었다. 분리된 Pasteurella multocida에 대한 약제 감수성 검사 결과 아미노글리코사이드 계통의 항생제인 겐타마이신과 가나마이신를 제거한 모든 약제에 민감하게 빈응하였다.
가창오리에서 분리한 Pasteurella multocida를 P-627 이라 명명하였으며 agar gel immuno diffusion 시험결과 균체 혈청형은 1 X 12 x 14 로 확인되었다. P. multocida 는 5종의 협막 혈청형(A, B, D, E, F) 이 있는 것으로 알려져 있으며, 그중 닭과 가축에서 주로 분리되는 A, B, D 혈청형을 동시에 감별할 수 있는 multiplex PCR 기법을 혈청형 동정에 적용하였다. 가창오리에 분리한 P-627 균주는 이 기법을 적용한 결과 협막 혈청형 A로 동정되었으며, A 형은 전세계에 널리 분포하고 있으며 주로 급성형의 가금콜레라의 원인균으로 알려져 있다. 또한 닭에 쉽게 분리되는 E. coli, Sal, pullorum, R. anatipestifer et al 과도 감별이 가능하였다. 따라서 multiplex PCR 기법을 1차 배양 후 의심 세균 집락에 적용할 경우 신속하고 정확하게 Pasteurella multocida의 혈청형을 동정할 수 있을 것으로 판단된다.
P-627의 균 독력을 알아보고자 5 주령 마우스에 회석 배율별로 복강내 균을 접종한 결과 접종 후 1-2일내 대부분 모두 폐사 되었으며 50% 반수치사량(LD_50) 은 1x10^0.5 CFU로 판명되어 매우 높은 균독력을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다.
또한 P-627 균가 국내 사육중인 가금류 (오리, 산란졔, 육용종계) 에 얼마나 병원성을 갖고 있는지 알아보고자 각 농도별로 근육 또는 기관내로 접종한 다음 폐사율을 관할하였다. 실험 감염된 가금류들은 대부분 접종 후 2-3일 이내에 폐사 되었으며 특히 근육 접종한 가금류들의 폐사율이 기관내로 감염된 개체들 보다 높았다. 죽은 모든 가금류에 대하여 육안적인 검사 결과 전형적인 가금콜레라의 병변이 확인되었으며 이들 개체에서 모두 Pasteurella multocida 가 분리 되었다. 위의 실험결과를 바탕으로 P-627 균이 국내 양계장이나 오리 농장으로 확산되었을 경우 심각한 폐사가 있었을 것으로 추측되었다.
P-627를 이용한 가금콜레라 병성기전 연구를 SPF 닭을 대상으로 실시하였다. P-627 균주를 기관내 접종한 다음 접종 후 6시간부터 120시간까지 시간대별로 병리조직검사, 면역화학적 염색법, 혈액내 미네랄검사, 균 재분리율 조사 등을 실시하였다. 죽은 닭들의 육안적인 병변으로는 급성 출혈성 패혈증 때 관찰되는 전신의 맥관계 층출혈이 확인되었으며 병리조직검사 결과 혈관내 섬유소성 혈전증이 주요 표적장기인 간장, 폐, 심장, 소장 등에서 빈번하게 확인되었다. P. multocida 항원의 시간대별 조직내 분포도를 조사하기 위하여 면역조직학적 염색법을 적용한 결과 접종 후 12시간부터 폐에서 처음 항원이 검출 되었으며, 24 시간이 경과하면서 전신의 실질장기, 즉 되, 갑상전, 흉선, 기관, 소장, 선위, 맹장, 간장, 폐, 심장, 비장 등에 특이적인 발색의 양성반응이 확인되었다. 면역 염색법과 비슷한 양상이 균 재분리율 조사에서도 관찰되었다. 접종 후 12시간부터 혈액, 간장, 비장에서 균이 분리되었으며 가장 높은 분리율은 접종 후 24시간과 36시간 때였다. 혈액내 철 농도(㎍/㎗) 검사에 서는 접종후 6시간때 63±14 수준이었던 것이 12시간, 24시간, 36시간대 각각 시간대 57±24, 17±10, 13±4.9 농도로 감소하여 발병기전과 철 농도와는 매우 밀접한 관계가 있는 것 으로 평가되었다.
위에서 확인된 결과를 바탕으로 기관을 통해 접종된 닭들은 급성의 패혈증에 의한 다양한 실질장기의 병변과 파종성 혈관 응고증의 형성에 의한 쇼크로 폐사되는 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT = iv
• LIST OF TABLE = viii
• LIST OF FIGURES = ix
• Chapter I. General introduction = 1
• 1. History and distibution = 1
• 2. Epidem iology = 2
• 3. Characteristics of Pasteurella multocida = 5
• 4. Clinical signs and patholoty = 7
• 5. Serotyping = 10
• 6. Genetics of Pasteurella multocida = 11
• 7. Aims of the study = 13
• Chapter II. An outbreak of fow 1 cholera in the Baikal teals (A nas form asa)
• ·Introduction = 16
• ·Materials and Methods = 19
• 1. Animals = 19
• 2. Necropsy and histopathology = 19
• 3. Bacterial isolation = 19
• 4. Biotype determ ination = 20
• 5. Antim icrobial susceptibility test = 20
• ·Results = 22
• 1. Case history = 22
• 2. Gross pathology = 24
• 3. Histopathology = 26
• 4. Microbiology = 28
• 5. Antim icrobial susceptibility = 30
• ·Discussion = 32
• ·Summary = 35
• Chapter III. Somatic and Capsular typing of pasteurella multocida, P-627 isolated from Baikal teals
• ·Introduction = 37
• ·Meterials and Methods = 40
• 1. Bacterial cultures = 40
• 2. Antisera and antigen for somatic typing = 40
• 3. Gel diffusion precipitin test = 41
• 4. DNA extractions = 41
• 5. PCR primers = 41
• 6. PCR conditions = 43
• ·Results = 44
• 1. Somatic typing = 44
• 2. Capsular typing = 46
• A. Multiplex PCR for capsular typing of pasteurella multocida = 46
• B. Determ ination on sensitivity of the multiplex PCR = 48
• C. Determ ination on sencificity of the multiplex PCR = 49
• ·Discussion = 51
• ·Summary = 55
• Chapter IV. pathogenesis of fow 1 cholera in the poultry experim entally infacted with pasteurella multocida, P-627 isolate
• ·Introduction = 57
• ·Meterials and Methods = 61
• 1. Pathogenicity of Pasteurella multocide, P-627 = 61
• 2. Pathogenesis of fow 1 cholera = 62
• A. Animals = 62
• B. Challenge = 62
• C. Experimental design = 62
• D. Histological examination = 63
• E. Reisolation of Pasteurella multocida = 63
• F. Disseminated intravascular coagulation examination = 64
• G. Immunohistochemistry = 64
• H. Trace minerals = 64
• I. Statistical analysis = 65
• ·Results = 66
• 1. Pathogenicity of P-627 isolate = 66
• A. Virulence for the mouse = 66
• B. Pathogenicity for poultry = 69
• C. Bacterial recoveries and postmortem examination = 73
• 2. Pathogenesis of fow 1 cholera = 74
• A. Clinical signs = 74
• B. Gross findings = 75
• C. Histopathologic findings = 77
• D. Frequency of Disseminated intravascular coagulation = 82
• E. Reisolation of Pasteurella multocida = 84
• F. Results of immunohistochemistry staining = 85
• G. Trace minerals = 88
• ·Discussion = 90
• ·Summary = 95
• REFERENCE = 97
• ASTRACT IN KOREAN = 116