Mechanism of Increased Sensitivity of Doxorubicin-resistant AML Sublines to Reactive Oxygen Species : 독소루비신 내성 급성 골수성 백혈병 아세포주에서 반응성 산소종에 대한 감수성 증가 기전에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

종양 세포에서 다약물 내성(multidrug resistance, MDR)의 출현은 성공적인 암의 화학요법의 주된 장애물이 되고 있다. Doxorubicin 내성 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML) 아세포주인 AML-2/DX100은 P-glycoprotein (Pgp)을 발현하지 않으면서 다약물 내성 관련 단백(MDR-associated protein, MRP)을 과발현하는 세포이다. AML-2/DX100은 약물감수성 모세포(AML-2/WT)와 비교해서 daunorubicin과 vincristine에 교차 내성을 보인 반면에 hydrogen peroxide에서는 5배, t-butyl hydroperoxide에서는 3배 그리고 methyl viologen에서는 2배로 감수성이 오히려 증가되어 있었다. AML-2/DX100에서 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 제거하는 superoxide dismutases, glutathione S-transferase, catalase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase와 같은 항산화 효소의 활성도를 측정한 결과 이들 항산화 효소 중에서 catalase의 활성도만이 AML-2/WT에 비해 1/3정도 감소되어 있었다(P < 0.000005). Catalase 효소 활성도의 감소는 catalase mRNA의 함량의 감소로 인해 단백질 양이 감소된 것임을 Western blot과 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의하여 확인할 수 있었다. Catalase 효소 활성도의 감소는 3개월간의 doxorubicin 없이 배양한 후 뿐만 아니라, MRP 억제제인 probenecid 처치시에도 계속되었다. 반면에 MRP를 과발현하는 다른 아세포주인 HL-60/Adr에서는 모세포인 HL-60/WT과 비교시 catalase 활성도의 차이가 없었다. 유전자 발현의 감소와 catalase 유전자의 methylation 상태의 관계를 규명하기 위하여 5-aza-2'-deoxycytidine (methyltransferase inhibitor)을 처치한 결과 catalase의 유전자 발현이 회복되지 못 하였다. HpaⅡ와 MspⅠ을 이용한 RFLP-southern blot 분석 결과 오히려 AML-2/DX100이 hypermethylation되어 있었다. 뿐만 아니라 hydrogen peroxide에 의한 catalase의 유도 정도도 두 세포간에 차이가 없었다.
이상의 결과를 종합하면 AML-2/DX100에서의 peroxides와 methyl viologen에 대한 감수성의 증가는 MRP의 과발현과는 무관하며 catalase 유전자 발현의 감소에 기인한 것으로 생각된다. 이러한 catalase 유전자 발현의 감소의 분자 기전으로서 DNA hypermethylation, 전사기구의 이상, 유전자수의 감소와는 무관한 기전에 의한 것으로 사료된다. 이와 같은 catalase 활성도의 감소는 내성세포에서 암의 화학요법에 있어서 하나의 새로운 표적물질로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• 국문초록
• Ⅰ. INTRODUCTION = 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 3
• Culture and selection for resistance to doxorubicin = 3
• Cytotoxicity assay = 3
• Activities of antioxidant enzymes = 4
• Protein extraction and Western blot analysis = 6
• RNA extraction and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay = 6
• Southern blot analysis = 8
• 5-aza-2'-deoxycytidine treatment and expression analysis = 9
• Analysis of methylation status = 10
• Induction Of catalase by H_(2)O_(2) = 10
• Protein determination = 10
• Statistical analysis = 10
• Ⅲ. RESULTS = 11
• Cross resistance of AML-2/DX100 to various cytotoxic substances = 11
• Difference of cellular levels of antioxidants between AML-2/WT and AML-2/DX100 = 13
• Effect of 5-aza-2'-deoxycytidine on the expression of catalase = 14
• Analysis of structural alteration and methylation status of catalase gene = 14
• Induction of catalase by H_(2)O_(2) = 15
• Ⅳ. DlSCUSSION = 32
• REFERENCES = 39