Nanomedicine-Based Controlled Drug Delivery and Chemo-immunotherapy Strategies for Enhanced Cancer Therapy

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chapter 1. Mesenchymal Stem Cell-Based CO2‑Bubble-Generating Liposomes for Targeted and Controlled Chemotherapy
Chemotherapeutic agents are widely used in cancer treatment but often induce severe off-target toxicity due to their nonspecific distribution. To address this limitation, we developed an innovative mesenchymal stem cell-based drug delivery system incorporating doxorubicin encapsulated in CO2-bubble generating thermosensitive liposomes （MSC-DOX-BG-LPs） for controlled and tumor-targeted DOX release under near-infrared （NIR） irradiation. MSCs inherently migrate to tumor tissues via CXCR4−CXCL12 chemotactic signaling, enabling precise tumor targeting. MSC-DOX-BG-LPs remain stable during systemic circulation and regulate DOX release in response to heat-induced liposomal destabilization and CO2 bubble formation, ensuring localized drug activation while minimizing systemic side effects. In vitro and in vivo experiments demonstrated that MSC-DOX-BG-LPs, upon NIR irradiation, effectively inhibited tumor proliferation and angiogenesis while inducing apoptosis in tumor cells （***P 〈 0.001）. Importantly, MSC-mediated delivery significantly enhanced drug accumulation within the tumor microenvironment, overcoming limitations associated with passive liposomal carrier delivery. These findings highlight MSC-DOX-BG-LPs as a promising platform for targeted chemotherapy that integrates tumor-specific migration with externally controlled drug release. This approach has the potential to improve therapeutic outcomes and prolong the survival of patients with various solid tumors.

Chapter 2. Cancer Nanovaccine Plus Doxorubicin and Immune Checkpoint Blockade Overcomes Chemoresistance and Delays Postsurgical Recurrence
Chemotherapy for solid tumors has serious limitations due to acquired chemoresistance and frequent postsurgical recurrence. In this study, we developed a chemo-immunotherapy regimen combining a chemotherapeutic agent, a dendritic cell （DC）-activating cancer nanovaccine, and immune checkpoint blockade （ICB） to overcome chemoresistance and improve long-term tumor control. Poly（lactic-co-glycolic acid） （PLGA） nanoparticles co-encapsulating a tumor-specific antigen （HPV E7 peptide） and an adjuvant （poly I:C）, termed PLGA （E7 + poly I:C）-NPs, were engineered as the nanovaccine platform. PLGA （E7 + poly I:C）-NPs promoted DC maturation and induced pro-inflammatory cytokine production. In a doxorubicin （DOX）-resistant tumor model, co-administration of PLGA （E7 + poly I:C）-NPs, DOX, and anti-PD-L1 antibody significantly reduced tumor burden, decreased tumor cell proliferation, and lowered microvessel density. This combination therapy also synergistically enhanced cytotoxic CD8⁺ T cell responses in both the spleen and tumor and delayed postsurgical recurrence, consistent with an increased effector memory T cell population. Moreover, MDR1 （ABCB1） expression was downregulated and the CD44⁺CD133⁺ cancer stem-like cell fraction was reduced, supporting reversal of chemoresistant features. Collectively, these findings demonstrate that integrating a cancer nanovaccine with chemotherapy and PD-L1 blockade can enhance antitumor immunity, overcome chemoresistance, and delay recurrence in chemoresistant tumors. This approach offers the potential to improve therapeutic outcomes and prolong survival in patients with various chemoresistant tumors.

국문 초록 (Abstract)

Chapter 1. 중간엽 줄기세포 기반 CO₂ 버블 생성 리포좀을 이용한 표적 및 제어 화학요법
화학요법제는 암 치료에 널리 사용되고 있으나, 비특이적 분포로 인해 심각한 비표적 독성을 유발하는 경우가 많다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본 연구에서는 독소루비신이 봉입된 CO₂ 버블 생성 열감응성 리포좀을 중간엽 줄기세포에 도입한 약물전달 시스템인 MSC-DOX-BG-LPs를 개발하였으며, 근적외선（NIR） 조사에 의해 제어되고 종양 표적적으로 DOX를 방출할 수 있도록 설계하였다. 중간엽 줄기세포는 CXCR4–CXCL12 화학주성 신호를 통해 종양 조직으로 본질적으로 이동할 수 있어, 정밀한 종양 표적화를 가능하게 한다. MSC-DOX-BG-LPs는 전신 순환 중 안정성을 유지하며, 열에 의해 유도되는 리포좀 불안정화와 CO₂ 버블 형성에 반응하여 DOX 방출을 조절함으로써, 전신 부작용을 최소화하면서 국소적인 약물 활성화를 보장한다. In vitro 및 in vivo 실험 결과, MSC-DOX-BG-LPs는 근적외선 조사 시 종양세포의 세포사멸을 유도하는 동시에 종양 증식과 혈관신생을 효과적으로 억제하였다（***P 〈 0.001）. 특히, 중간엽 줄기세포 매개 전달은 종양 미세환경 내 약물 축적을 유의하게 향상시켰으며, 수동적 리포좀 운반체 전달과 관련된 한계를 극복하였다. 이러한 결과는 MSC-DOX-BG-LPs가 종양 특이적 이동성과 외부 자극에 의해 제어되는 약물 방출을 통합한 표적 화학요법 플랫폼으로서 유망함을 보여준다. 본 접근법은 다양한 고형암 환자의 치료 결과를 개선하고 생존 기간을 연장할 수 있는 잠재력을 가진다.

Chapter 2. 암 나노백신, 독소루비신 및 면역관문차단 병용요법을 통한 화학요법 저항성 극복과 수술 후 재발 지연
고형암에 대한 화학요법은 획득성 화학요법 저항성과 빈번한 수술 후 재발로 인해 심각한 한계를 가진다. 본 연구에서는 화학요법 저항성을 극복하고 장기적인 종양 제어 효과를 향상시키기 위해, 화학요법제, 수지상세포를 활성화하는 암 나노백신, 그리고 면역관문차단제를 병용하는 화학-면역치료 전략을 개발하였다. 종양 특이적 항원인 HPV E7 펩타이드와 면역증강제인 poly I:C를 동시에 봉입한 poly（lactic-co-glycolic acid） （PLGA） 나노입자, 즉 PLGA （E7 + poly I:C）-NPs를 암 나노백신 플랫폼으로 제작하였다. PLGA （E7 + poly I:C）-NPs는 수지상세포 성숙을 촉진하고 전염증성 사이토카인의 생성을 유도하였다. 독소루비신（doxorubicin, DOX） 저항성 종양 모델에서 PLGA （E7 + poly I:C）-NPs, DOX 및 anti-PD-L1 항체의 병용 투여는 종양 부담을 유의하게 감소시키고, 종양세포의 증식과 미세혈관 밀도를 낮추었다. 또한, 이 병용요법은 비장과 종양 모두에서 세포독성 CD8⁺ T 세포 반응을 상승적으로 향상시켰으며, 증가된 효과기 기억 T 세포 집단과 일치하게 수술 후 재발을 지연시켰다. 더불어, MDR1 （ABCB1）의 발현이 하향 조절되고 CD44⁺CD133⁺ 암 줄기세포 유사 세포 분획이 감소하였으며, 이는 화학요법 저항성 특성의 역전을 뒷받침한다. 종합적으로, 본 연구 결과는 암 나노백신을 화학요법 및 PD-L1 차단과 통합하는 전략이 항종양 면역을 강화하고, 화학요법 저항성을 극복하며, 화학요법 저항성 종양에서 재발을 지연시킬 수 있음을 보여준다. 본 접근법은 다양한 화학요법 저항성 종양 환자에서 치료 성과를 개선하고 생존 기간을 연장할 수 있는 잠재력을 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Mesenchymal Stem Cell-Based CO2‑Bubble-Generating Liposomes for Targeted and Controlled Chemotherapy 12
• 1.1. Introduction 12
• 1.2. Materials and Methods 17
• 1.2.1. Materials 17
• 1.2.2. Preparation of DOX-BG-LPs 17
• 1.2.3. Intracellular delivery efficiency of DOX-BG-LPs into MSCs 18
• 1.2.4. Release of DOX from DOX-BG-LPs and MSC-DOX-BG-LPs upon temperature increase or NIR irradiation 19
• 1.2.5. Cell viability of MSCs 20
• 1.2.6. Migration of MSC-DOX-BG-LPs to tumor cell–conditioned media （CMs） 20
• 1.2.7. Accumulation of MSC-BG-LPs in TME 20
• 1.2.8. Antitumor efficacy 21
• 1.2.9. Immunohistochemistry （IHC） staining 22
• 1.2.10. Western blot analysis 22
• 1.3. Results 23
• 1.3.1. Characteristics of DOX-BG-LPs 23
• 1.3.2. Intracellular delivery efficiency of DOX-BG-LPs into MSCs 25
• 1.3.3. Release of DOX from MSC-DOX-BG-LPs following NIR irradiation 28
• 1.3.4. Migration of MSC-DOX-BG-LPs to tumor cells through CXCR4–CXCL12 axis 30
• 1.3.5. Accumulation of DOX within TME 33
• 1.3.6. Therapeutic efficacy 36
• 1.4. Discussion 40
• Chapter 2. Cancer Nanovaccine Plus Doxorubicin and Immune Checkpoint Blockade Overcomes Chemoresistance and Delays Postsurgical Recurrence 12
• 2.1. Introduction 44
• 2.2. Materials and Methods 49
• 2.2.1. Materials 49
• 2.2.2. Preparation of PLGA （E7 + poly I:C）-NPs 50
• 2.2.3. Cell viability assay 50
• 2.2.4. Establishment of a mouse model of DOX-resistant tumors 51
• 2.2.5. Generation of DCs from mouse bone marrow 52
• 2.2.6. Intracellular uptake of PLGA （E7 + poly I:C）-NPs in DCs 52
• 2.2.7. DC maturation and cytokine generation 52
• 2.2.8. Evaluation of the antitumor efficacy of the combination therapy 53
• 2.2.9. Analysis of systemic and intratumoral IFN-γ⁺ CD8⁺ T cell responses 54
• 2.2.10. Western blot analysis 54
• 2.2.11. Immunohistochemistry （IHC） staining 55
• 2.2.12. Biochemical and histological toxicity of PLGA （E7 + poly I:C）-NPs in vivo 55
• 2.2.13. Establishment of a tumor recurrence model after surgical resection 56
• 2.2.14. Statistical analysis 57
• 2.3. Results 57
• 2.3.1. Establishment and validation of a DOX-resistant TC-1 model 57
• 2.3.2. Physical characteristics of PLGA （E7 + poly I:C）-NPs 61
• 2.3.3. Intracellular uptake of PLGA （E7 + poly I:C）-NPs and maturation of DCs 63
• 2.3.4. Antitumor efficacy of the combination therapy 65
• 2.3.5. Histology and IHC reveal the effects of the combination therapy 68
• 2.3.6. Evaluation of toxicity 71
• 2.3.7. Assessment of tumor recurrence in TC-1-DOX tumor bearing mice 73
• 2.4. Discussion 76
• References 79