Identification and Characterization of novel epimerases and its application in rare sugar bioconversion

국문 초록 (Abstract)

D-알룰로스는 저칼로리 희소당으로 식품 및 제약 산업에서 활용 가능성이 높은 기능성 감미료이다. 산업적 생산은 주로 ketose 3-epimerase에 의해 촉매되는 D-과당（D-fructose）의 효소적 전환에 의존한다. 본 연구에서는 총 221개의 세균 균주를 스크리닝하여 Microbacterium paraoxydans와 Microbacterium arabinogalactanolyticum을 선발하였다. 전장 유전체 분석을 통해 후보 ribulose 3-epimerase（R3E） 유전자를 확인한 후, 이를 Escherichia coli BL21에서 클로닝, 발현 및 정제하여 생화학적 특성을 분석하였다.
두 효소는 모두 Mn²⁺ 존재 하의 약알칼리성 조건에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 또한 다양한 케토스 기질에 대해 넓은 기질 특이성을 보였으며, D-알룰로스 생산에서 약 28%의 유사한 평형 전환율을 달성하였다. 효소 반응속도론 분석 결과, P-R3E는 A-R3E（Kcat = 2437 min⁻¹）보다 높은 촉매 회전수（Kcat = 3577.7 min⁻¹）를 나타냈다. 열안정성 분석에서도 P-R3E는 A-R3E보다 우수한 열안정성과 잔존 활성을 보였다.
종합적으로, 본 연구에서는 Microbacterium 유래의 새로운 ribulose 3-epimerase 두 종을 발굴하고 특성화하였다. 이 중 P-R3E는 우수한 촉매 활성과 열안정성을 나타내어 산업적 D-알룰로스 생산을 위한 유망한 생촉매로서의 활용 가능성을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• 1. D-allulose as a low-calorie rare sugar 1
• 2. Bioconversion of D-fructose to D-allulose 3
• 3. Ketose 3-epimerases for the synthesis of D-allulose 5
• 4. Limitation of current epimerases 10
• 5. Potential of Novel Epimerases from Microbacterium 11
• II. MATERIALS AND METHODS 13
• 1. Materials and bacteria culture 13
• 2. Methods 13
• 2.1. Screening bacterial strains producing fructose from allulose 13
• 2.2. Fructose Colorimetric Assay 14
• 2.4. Genome sequencing and identification of epimerase genes 16
• 2.5. Gene Cloning, Protein Expression and Purification 17
• 2.6. SDS-PAGE Analysis 21
• 2.7. Size Exclusion Chromatography 21
• 2.8. Assay for effect of metal cofactor 22
• 2.9. Assay for temperature dependency 23
• 2.10. Assay for pH dependency 23
• 2.11. Substrate Specificity 23
• 2.12. Determination of Kinetic Parameter of P-R3E and A-R3E 24
• 2.13. Enzyme Activity Assay 24
• 2.14. Differential Scanning Fluorimetry 24
• 2.15. R3E Enzyme Residual Activity 25
• 2.16. Structural Modeling and Structural Alignment Analysis 26
• 2.17. Statistical analyses and presentation of data 26
• Ⅲ. Results 27
• 1. Biological Characterization of Allulose producing strain 27
• 2. Identification of Allulose-utilizing Microbacterium sp. epimerases 31
• 2.1 Amino acid sequence analysis 35
• 3. Preparation of epimerases and characterization 39
• 3.1. Gene Cloning, Protein Expression and Protein Purification 39
• 3.2. Optimum Metal Cofactor profile of P-R3E and A-R3E 42
• 3.3. Optimum pH profile of P-R3E and A-R3E 45
• 3.4. Optimum Temperature profile of P-R3E and A-R3E 47
• 3.5. Substrate Preference of P-R3E and A-R3E 49
• 4. Determination of kinetic parameters 52
• 5. Thermal Stability of P-R3E and A-R3E 61
• 6. Model Structure Analysis 70
• IV. Discussion 74
• V. Conclusion 91
• VI. References 93