NMR 및 UPLC-Q-TOF-MS/MS를 이용한 녹두(vigna radiata) 전초 유래 플라보노이드의 구조 동정 및 생물학적 활성 규명

국문 초록 (Abstract)

최근 콩과 작물의 소비와 기능성식품에 대한 관심이 지속적으로 증가함에 따라 다양한 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 대두, 완두, 팥 등 주요 콩과 작물에 대해서는 기능성 대사체 연구가 활발히 이루어져 있으나 녹두 （Vigna radiata） 전초를 대상으로 한 체계적인 대사체 분석 및 기능성 평가 연구는 상대적으로 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 녹두 전초를 대상으로 NMR과 UPLC-Q-TOF-MS/MS를 이용하여 대사체를 구조 동정하고, 주요 대사체를 기반으로 최적 추출 조건을 확립한 후, 최적 추출물의 생리활성을 평가하였다. 연구 결과는 다음과 같다. 1. 녹두 전초 추출물로부터 분리 및 정제한 단일성분의 NMR 분석결과, 총 14종의 flavonoid 계열 물질의 구조를 동정하였다. 이 가운데 11종은 isoflavone 유도체와 3종의 flavone 유도체로 확인되었다. 특히 isoflavone 유도체에는 녹두 특이 대사체인 4종의 2′-hydroxydaidzein 유도체를 비롯하여 daidzein 유도체 4종과 genistein 유도체 3종이 포함되어 녹두 전초의 특이적인 flavonoid 조성을 확인할 수 있었다. 2. UPLC-Q-TOF-MS/MS 음이온 모드를 이용한 대사체 분석 결과, 총 21종의 화합물을 확인하였다. 검출된 화합물은 isoflavone 7종, flavone 7종, flavanone 3종, flavonol 2종 및 기타 화합물 2종으로 구성되었다. 또한 HPLC를 이용한 화합물 분리 및 NMR 데이터와 고해상도 질량분석 데이터를 종합적으로 비교한 결과, 6종의 isoflavone（2′-hydroxydaidzin, daidzin, 2′-hydroxydaidzein, daidzein, glycitein, genistein）과 3종의 flavone（vitexin, isovitexin, rutin）이 공통적으로 확인되어 구조 동정 결과의 신뢰성을 뒷받침하였다. 3. 구조 동정된 14종의 화합물을 기준으로 최적 추출 조건을 확립한 결과, pH 7에서 70% methanol을 용매로 사용하여 45℃에서 18시간 추출하였을 때 생리활성 성분들이 가장 안정적이고 효율적으로 추출됨을 확인하였다. 특히 용매 조성에 따른 비교에서는 100% methanol 대비 70% methanol 추출물에서 총 함량이 1491.9 µg/g → 2188.2 µg/g으로 유의미하게 증가하였다. 최적 추출 조건을 적용한 부위별 분석에서는 유효성분이 뿌리 （1,128.9 µg/g） 〉 잎 （702.0 µg/g） 〉 줄기 （50.4 µg/g） 순으로 축적되어 있음을 확인하였다. 4. 최적 추출물을 이용하여 항산화 및 효소 활성 억제 능력을 평가한 결과, DNA 절단 보호 활성은 250 µg/mL에서 80.8%, 500 µg/mL에서 100%를 나타내어 비교적 낮은 농도에서도 우수한 보호 효과를 보였다. ABTS+ 자유라디칼 소거 활성은 1000 µg/mL에서 79.2%로 나타나 동일 농도의 DPPH 라디칼 소거 활성（38.0%） 보다 약 2배 높은 활성을 나타내었으며, 전체적인 항산화 활성은 DNA 절단 보호 〉 ABTS+ 〉 DPPH 〉 FRAP 순으로 평가되었다. 또한 피부 노화 및 대사 질환 관련 효소 저해 활성에서는 1000 µg/mL에서 tyrosinase 70.3% → 53.6%, elastase는 74.4% → 40.8%, α-glucosidase는 49.5%의 저해 활성을 나타내어 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다. 종합하면, 본 연구는 녹두 전초의 flavonoid 대사체를 체계적으로 규명하고 최적 추출 조건을 확립함과 동시에 우수한 항산화 및 효소 저해 활성을 검증하였다. 특히 녹두 특이 isoflavone 유도체를 포함한 다양한 기능성 대사체의 분포를 규명함으로써 녹두 전초의 기능성 식품, 건강기능식품 및 천연물 소재로서의 활용 가능성에 대한 기초 자료를 제공할 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ.서론 1
• Ⅱ.재료 및 방법 4
• 1.실험 재료 및 장비 4
• 1.1.녹두 전초 생장 조건 4
• 1.2.실험 시약 5
• 1.3.실험 장비 6
• 2.실험 전처리 7
• 2.1.대사체 분석 전처리 7
• 2.2.생물학적 활성 평가 전처리 7
• 3.녹두 전초 유래 대사체 추출 및 분리 8
• 3.1.녹두 전초 대량 추출 및 분획 8
• 3.2.H2O 분획층의 화합물 분리 8
• 3.3.BtOH 분획층의 화합물 분리 9
• 4.UPLC-Q-TOF-MS/MS 및 HPLC 분석 조건 11
• 4.1.UPLC-Q-TOF-MS/MS 분석 조건 11
• 4.2.HPLC 분석 조건 13
• 5.생물학적 활성 평가 15
• 5.1.DPPH 자유라디칼 소거 능력 평가 15
• 5.2.ABTS+ 자유라디칼 소거 능력 평가 16
• 5.3.FRAP 철 이온의 환원 능력 평가 17
• 5.4.DNA 보호 능력 평가 18
• 5.5.Tyrosinase 효소 활성 억제 능력 평가 19
• 5.6.Elastase 효소 활성 억제 능력 평가 20
• 5.7.α-glucosidase 효소 활성 억제 능력 평가 21
• Ⅲ.결과 및 고찰 22
• 1.녹두 전초 유래 14종 대사체 구조 동정 22
• 1.1.핵자기공명분광분석기를 이용한 14종 대사체 구조 22
• 1.2.Isoflavone 계열 대사체 구조 동정 23
• 1.2.1.2′-Hydroxydaidzein-4′,7-diglucoside （1）의 NMR 분석 23
• 1.2.2.4″,4‴-Methyl-O-daidzein-4′,7-diglucoside （2）의 NMR 분석 29
• 1.2.3.Daidzein-4′,7-diglucoside （3）의 NMR 분석 35
• 1.2.4.2′-Hydroxydaidzin （4）의 NMR 분석 38
• 1.2.5.Daidzin （5）의 NMR 분석 44
• 1.2.6.4″-Methyl-O-2′-Hydroxydaidzin （6）의 NMR 분석 47
• 1.2.7.Genistin （10）의 NMR 분석 50
• 1.2.8.2΄-Hydroxydaidzein （11）의 NMR 분석 53
• 1.2.9.Daidzein （12）의 NMR 분석 56
• 1.2.10.Glycitein （13）의 NMR 분석 58
• 1.2.11.Genistein （14）의 NMR 분석 59
• 1.3.Flavone 계열 대사체 구조 동정 61
• 1.3.1.Vitexin （7）의 NMR 분석 61
• 1.3.2.Isovitexin （8）의 NMR 분석 67
• 1.3.3.Rutin （9）의 NMR 분석 73
• 2.UPLC-Q-TOF-MS/MS를 이용한 대사체 프로파일링 76
• 2.1.음이온 모드 분석 76
• 2.1.1.2′-Hydroxydaidzin （1）의 MS 및 MS/MS 분석 77
• 2.1.2.Dulcinoside （2）의 MS 및 MS/MS 분석 78
• 2.1.3.Hesperidin （3）의 MS 및 MS/MS 분석 79
• 2.1.4.Trilobatin （4）의 MS 및 MS/MS 분석 80
• 2.1.5.Eriodictyol-7-O-glucoside （5）의 MS 및 MS/MS 분석 81
• 2.1.6.Tricin-7-O-glucoside （6）의 MS 및 MS/MS 분석 82
• 2.1.7.Naringin （7）의MS 및 MS/MS 분석 83
• 2.1.8.Chrysoeriol-7-O-glucuronide （8）의 MS 및 MS/MS 분석 84
• 2.1.9.Daidzin （9）의 MS 및 MS/MS 분석 85
• 2.1.10.Apigenin-7-O-glucoside （10）의 MS 및 MS/MS 분석 86
• 2.1.11.Vitexin （11）의 MS 및 MS/MS 분석 87
• 2.1.12.Isovitexin （12）의 MS 및 MS/MS 분석 88
• 2.1.13.Rutin （13）의 MS 및 MS/MS 분석 89
• 2.1.14.Genistin （14）의 MS 및 MS/MS 분석 90
• 2.1.15.Chrysin-7-O-glucuronide （15）의 MS 및 MS/MS 분석 91
• 2.1.16.Nicotiflorin （16）의 MS 및 MS/MS 분석 92
• 2.1.17.2′-Hydroxydaidzein （17）의 MS 및 MS/MS 분석 93
• 2.1.18.Daidzein （18）의 MS 및 MS/MS 분석 94
• 2.1.19.Glycitein （19）의 MS 및 MS/MS 분석 95
• 2.1.20.Genistein （20）의 MS 및 MS/MS 분석 96
• 2.1.21.Coumestrol （21）의 MS 및 MS/MS 분석 97
• 3.최적 추출 조건 확립 및 부위별 함량 분석 100
• 3.1.정량 분석을 위한 단일성분 표준화 100
• 3.2.최적 추출 조건 확립 101
• 3.2.1.용매에 따른 추출 함량 변화 101
• 3.2.2.용매 비율에 따른 추출 함량 변화 101
• 3.2.3.추출 시간 및 온도, 용매 pH에 따른 추출 함량 변화 103
• 3.3.최적 추출 조건에 따른 부위별 함량 비교 108
• 4.최적 추출 조건 기반의 생물학적 활성 평가 111
• 4.1.DPPH 자유라디칼 소거 능력 결과 111
• 4.2.ABTS+ 자유라디칼 소거 능력 결과 112
• 4.3.FRAP 철 이온의 환원 능력 결과 113
• 4.4.DNA 보호 능력 결과 115
• 4.5.Tyrosinase 효소 활성 억제 능력 결과 117
• 4.6.Elastase 효소 활성 억제 능력 결과 118
• 4.7.α-glucosidase 효소 활성 억제 능력 결과 119
• Ⅳ.결론 121
• 참고문헌 124
• Abstract 129