Identification and Functional Analysis of cis-Regulatory Elements Controlling Nonhair Cell-Position Preferential Expression of the WEREWOLF in Arabidopsis thaliana = 애기장대에서 WEREWOLF 유전자의 비뿌리털 세포 위치 편향적 발현을 조절하는 시스 조절 요소의 규명 및 기능적 분석

국문 초록 (Abstract)

애기장대에서 WEREWOLF 유전자의 비뿌리털 세포 위치 편향적 발현을 조절하는 시스 조절 요소의 규명 및 기능적 분석 김 요 한 지도교수 : 송 상 기 글로벌바이오융합학과 조선대학교 대학원 식물에서 조직 특이적 유전자 발현은 세포 분화와 기관 형성을 조절하는 핵심적인 분 자적 기작이며, 이러한 발현을 매개하는 시스-조절 요소（cis-regulatory elements）의 기능을 규명하는 것은 유전자 발현 조절의 분자적 기초를 이해하는 데 중요한 의미를 가진다. 모 델 식물인 Arabidopsis thaliana의 뿌리 표피세포는 하부 피층 세포와의 상대적 배열에 따 라 뿌리털 세포（hair cell, H-cell） 또는 비뿌리털 세포（non-hair cell, N-cell）로 분화한다. 이러 한 위치 의존적 분화는 정교한 유전자 조절 네트워크에 의해 제어된다. 특히 R2R3-MYB 전사인자인 WEREWOLF （WER）는 GLABRA2 （GL2） 및 CAPRICE （CPC） 등의 유전자 발현 을 조절함으로써 비뿌리털 세포（N-cell）의 형성을 유도하고, 뿌리 표피세포의 운명 결정에 핵심적인 역할을 한다. 또한 애기장대에서 WER 프로모터는 N-position 표피세포와 측면 뿌리골무（lateral root cap） 세포에서 선택적으로 발현하는 것으로 알려져 있다. 선행 연구에서는 WER 유전자의 대립유전자에 대한 T-DNA 삽입 위치와 전사 수준을 분석하였으며, GL2p:GUS 리포터와의 교배를 통해 WER 발현 패턴과 N-cell 분화 위치를 확인하였다. 또한 이러한 분석을 통해 N-position 선택적 WER 발현에 필요한 최소 프로모 터 영역과 WER 터미네이터의 중요성이 제시된 바 있다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 본 연구에서는 WER 프로모터의 N-position 선택적 발현을 조절하는 시스-조절 요소를 규명 하는 것을 주요 연구 목표로 하였다. 이를 위해 먼저 WER 프로모터의 조직 특이적 발현을 조절하는 핵심 영역을 규명하 기 위하여 다양한 길이의 프로모터 절편을 이용한 단계적 절단 분석과 내부 치환 돌연변 이 분석을 수행하였다. 그 결과 번역 개시점 상류 −420에서 −346 bp 구간이 N-position 선 택적 발현에 중요한 역할을 하는 핵심 프로모터 영역임을 확인하였다. 특히 −405에서 −361 bp 구간은 N-position 특이적 발현에 필수적인 조절 영역으로 나타났다. 또한 −420/−391, −405/−376, −390/−361, −375/−346 bp에 해당하는 네 개의 코어 서열을 이용한 합성 프로모터 분석을 수행하였다. 그 결과 WER 프로모터 내에는 N-position 발현을 유도 하는 최소 두 개의 시스-조절 요소 （NE1, NE2）와 뿌리골무 특이적 발현을 유도하는 조절 요소 （RCE）가 존재함을 확인하였다. 또한 WER 터미네이터 （TWER）의 존재 하에서 WER 프로모터의 기저 발현에 관여하 는 영역을 규명하기 위하여 중첩 결실된 프로모터 구성체를 제작하고 GUS 발현을 분석 하였다. 그 결과 특정 구간이 제거된 경우에만 발현이 소실되는 현상이 관찰되었으며, 해 당 영역이 TWER과 함께 WER 프로모터의 기저 발현 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 더 나아가 TWER와 WER genomic DNA를 포함한 구성체를 wer 돌연변이체에 도입하고 GL2p:GUS 리포터와의 교배를 통해 상보성 검정을 수행하였다. 그 결과 매우 낮 은 수준의 WER 발현만으로도 wer 돌연변이의 표현형이 효과적으로 회복됨을 확인하였 다. 마지막으로 WER 프로모터에서 확인된 핵심 시스-조절 요소의 진화적 보존성을 조사 하기 위하여 Brassicaceae 식물의 WER-like （WRL） 유전자 프로모터 서열을 비교 분석하였 다. 그 결과 N-position 선택적 발현에 관여하는 핵심 프로모터 서열이 선별된 Brassicaceae 종의 WRL 프로모터에서 부분적으로 보존되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 뿌리 표 피세포에서의 위치 의존적 유전자 발현을 조절하는 시스-조절 기작이 Brassicaceae 식물 군에서 진화적으로 보존되어 왔을 가능성을 시사한다. 종합적으로 본 연구는 애기장대 뿌리 표피세포에서 WER 유전자의 위치 특이적 발현 을 조절하는 시스-조절 요소를 기능적으로 규명하였다. 또한 이러한 조절 요소들이 협력 적으로 작용하여 N-position 특이적 유전자 발현을 형성한다는 조절 구조를 제시하였다. 본 연구 결과는 식물에서 위치 의존적 유전자 발현 조절 기작에 대한 이해를 확장하고, 뿌 리 표피세포 운명 결정의 전사 조절 메커니즘을 이해하는 데 중요한 기초 자료를 제공할 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Identification and Functional Analysis of cis-Regulatory Elements Controlling Nonhair Cell-Position Preferential Expression of the WEREWOLF in Arabidopsis thaliana Kim, Yo Han Advisor: Prof. Song, Sang Kee, Ph.D. Department of Integrative Biological Sciences, Graduate School of Chosun University Tissue-specific gene expression in plants plays a fundamental role in regulating cell differentiation and organ development. Understanding the functions of cis-regulatory elements that mediate such expression is therefore essential for elucidating the molecular mechanisms underlying transcriptional regulation. In the model plant Arabidopsis thaliana, root epidermal cells differentiate into either hair cells （H-cell） or non-hair cells （N-cells） depending on their positional relationship with the underlying cortical cells. This positional differentiation is governed by a complex gene regulatory network. Among the key regulators, the R2R3-MYB transcription factor WEREWOLF （WER） plays a central role in root epidermal cell fate determination by regulating the expression of downstream genes such as GLABRA2 （GL2） and CAPRICE （CPC）, thereby promoting the formation of N-cells. In addition, the WER promoter is known to be preferentially expressed in epidermal cells located at the N-position as well as in the lateral root cap in Arabidopsis roots. Previous studies have analyzed the T-DNA insertion sites and transcriptional activity of WER alleles and examined the expression pattern of WER through genetic crosses with the GL2p:GUS reporter line, thereby confirming the positional pattern of N-cell differentiation. These studies also suggested the minimal promoter region required for N-position-specific expression and highlighted the importance of the WER terminator in regulating WER transcription. Based on these findings, the present study aimed to identify the cis-regulatory elements responsible for N-position preferential expression of the WER promoter. To identify the promoter regions responsible for positional expression, a series of progressive promoter deletions and internal substitution constructs were generated and analyzed using GUS reporter assays. These analyses revealed that the region between -420 and -346 bp upstream of the translation start site represents a critical promoter region required for N-position preferential expression. In particular, the region between −405 and −361 bp was identified as a functionally important distal promoter interval contributing to preferential WER expression. Further functional analyses using synthetic promoter constructs containing tandem repeats of four candidate core sequences （-420/-391, -405/-376, -390/-361, and -375/-346 bp） demonstrated that the WER promoter contains at least two N-position-specific expression elements （NE1 and NE2） that mediate preferential expression in N-position epidermal cells, as well as a root cap expression element （RCE） involved in root cap-specific expression. In addition, to identify promoter regions involved in basal transcriptional activity of the WER promoter in the presence of the WER terminator （TWER）, overlapping deletion constructs were generated and analyzed for GUS expression. The results indicated that removal of specific promoter segments results in the loss of reporter gene expression, suggesting that this region plays an important role in basal transcriptional regulation in combination with the TWER sequence. Furthermore, constructs containing TWER and WER genomic DNA were introduced into the wer mutant background, and complementation analyses were performed by crossing these lines with the GL2p:GUS reporter. These experiments demonstrated that even a very low level of WER expression was sufficient to effectively restore the wer mutant phenotype. Finally, to investigate the evolutionary conservation of the regulatory elements identified in the WER promoter, promoter sequences of WER-like （WRL） genes from Brassicaceae species were comparatively analyzed. Sequence alignment revealed that key promoter regions associated with N-position preferential expression are partially conserved among selected Brassicaceae species. These findings suggest that the cis-regulatory mechanisms controlling positional gene expression in root epidermal cells may be evolutionarily conserved within the Brassicaceae lineage. Taken together, this study functionally identified cis-regulatory elements that regulate positional expression of the WER gene in the root epidermis of Arabidopsis thaliana. Furthermore, the results suggest that these regulatory elements cooperatively contribute to the establishment of N-position specific gene expression. These findings provide new insights into the regulatory architecture underlying positional gene expression and contribute to a better understanding of the transcriptional mechanisms governing root epidermal cell fate determination in plants.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 16
• 1. Plant materials and growth conditions of Arabidopsis 16
• 2. Culture media preparation 17
• 2.1. Luria–Bertani （LB） medium 17
• 2.2. Half-strength Murashige and Skoog （½ MS） medium 17
• 3. Preparation of WER promoter constructs and plasmid cloning 18
• 4. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis 32
• 5. Selection of transgenic plants 33
• 6. Histochemical GUS assay 33
• 7. Microscopic observation and imaging 34
• 8. Comparative sequence analysis of WER-like promoter regions 34
• 9. Identification of the transcription start site （TSS） by 5′ RACE 36
• III. RESULTS 37
• 3.1. Identification of distal cis-regulatory regions associated with preferential WER expression 37
• 3.2. Functional characterization of distal cis-regulatory elements 44
• 3.3. Identification of proximal promoter regions contributing to sustained WER expression 51
• 3.4. Functional analysis of proximal tandem repeat core elements 57
• 3.5. Identification of the transcription start sites of WER by 5′ RACE 64
• 3.6. Identification and phylogenetic analysis of WER-like （WRL） orthologs in Brassicaceae species 66
• 3.7. Comparative analysis of conserved promoter regions among Brassicaceae WRL genes 70
• Ⅳ. DISCUSSION 76
• Ⅴ. CONCLUDING REMARKS 83
• REFERENCES 85