Antimicrobial Peptide Design and Membrane Biophysics : A Structure Activity Relationship Approach = 항균 펩타이드 설계 및 세포막 생물리학: 구조-활성 상관관계 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

PART I
BMAP-18, derived from the N-terminal region of bovine myeloid antimicrobial peptide BMAP-27, demonstrates potent antimicrobial activity without cytotoxicity. This study aimed to compare the antibacterial, antibiofilm, and anti-inflammatory properties of BMAP-18, rich in aromatic phenylalanine residues, with its aliphatic analog, BMAP-18-FL. Both aromatic BMAP18 and aliphatic BMAP-18-FL exhibited equally potent antimicrobial activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria, particularly methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） and multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa （MDRPA）. Mechanistic investigations employing SYTOX green uptake, DNA binding, and FACScan analysis revealed that both peptides acted by inducing membrane permeabilization and subsequent intracellular targeting. Moreover, both BMAP-18 and BMAP-18-FL effectively prevented biofilm formation and eradicated existing biofilms of MRSA and MDRPA. Notably, BMAP-18-FL displayed a superior anti-inflammatory activity compared to BMAP-18, significantly reducing the expression levels of pro-inflammatory cytokines in lipopolysaccharide-stimulated macrophages. This study emphasizes the similarities and differences in the antimicrobial, antibiofilm, and anti-inflammatory properties between aromatic BMAP-18 and aliphatic BMAP-18-FL, providing valuable insights for the development of multifunctional antimicrobial peptides against drug-resistant bacteria.

PART II
The rise of multidrug-resistant （MDR） bacteria calls for new antimicrobials that combine broad activity with minimal host toxicity. Four short cationic peptides: RL-12, RF-12, KL-12, and KF-12 were designed to dissect how aromatic versus aliphatic hydrophobic residues and guanidinium （Arg） versus primary amine （Lys） cationic groups govern antimicrobial function. Helical wheel projections and circular dichroism spectra showed that all peptides adopt amphipathic helical conformations in membrane-mimetic environments. Nevertheless, arginine-rich RL-12 and RF-12 displayed markedly lower minimum inhibitory concentrations （MICs） against Gram-positive, Gram-negative, and drug-resistant strains than their lysine-rich counterparts KL-12 and KF-12. RL-12 and RF-12 also exhibited superior inhibition and eradication of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa biofilms and induced stronger outer and inner membrane disruption, as demonstrated by N-phenyl-1-naphthylamine （NPN） uptake, calcein leakage, and propidium iodide flow cytometry. Despite higher antibacterial potency, arginine-based peptides maintained acceptable cytocompatibility toward macrophage and microglial cells, whereas KF-12 showed the widest safety margin. All peptides attenuated lipopolysaccharide-induced TNF-α, IL-6, and nitric oxide production, with leucine-containing analogues showing the most balanced anti-inflammatory profiles. Critically, this study reveals that homopolymeric sequences cannot recapitulate the cell-compatible, multifunctional profile of natural host-defence peptides, which achieve their remarkable balance through heterogeneous mixtures of aliphatic, aromatic, guanidinium, and amine chemistries. These results provide rational design principles for next-generation antimicrobial peptides with improved selectivity.

PART III
Giant plasma membrane vesicles （GPMVs） are cell-derived model systems that preserve the lipid composition and lateral organization of native plasma membranes, making them valuable tools for studying membrane phase separation and protein partitioning. In this study, GPMVs were generated from BV-2 microglial and RAW 264.7 macrophage cells to examine how pattern recognition receptors Toll like receptor 4 （TLR4） and CD14 distribute between Lo and Ld domains under basal conditions and after lipopolysaccharide （LPS） stimulation. Phase separation was visualized using the Lo marker CTxB and the Ld dyes DiO/DiI/DiD, which showed robust, complementary partitioning and confirmed clear domain formation in both cell types. TLR4, labeled with Alexa Fluor 488, was detectable on the membranes of RAW 264.7 and LPS stimulated BV-2 derived GPMVs but did not show strong enrichment in either GM1 rich （Lo） or DiO/DiD rich （Ld） regions, suggesting that under the present conditions TLR4 samples both phases rather than functioning as a strictly raft restricted or non-raft receptor. In contrast, CD14 fluorescence on BV-2 GPMVs was weak or undetectable, preventing reliable assessment of its domain preference. These findings demonstrate that GPMVs from inflammatory cell lines provide a useful platform for visualizing raft–non-raft organization and indicate that further optimization of stimulation and labelling protocols will be needed to quantitatively resolve subtle changes in TLR4 and CD14 partitioning during LPS-induced signaling.

국문 초록 (Abstract)

PART I
소 골수성 항균 펩타이드 BMAP-27의 N-말단 영역에서 유래한 BMAP-18은 세포 독성 없이 강력한 항균 활성을 나타냅니다. 이 연구는 방향족 페닐알라닌 잔기가 풍부한 BMAP-18의 항균, 항균 및 항염증 특성을 지방족 유사체인 BMAP-18-FL과 비교하는 것을 목표로 했습니다. 방향족 BMAP 18과 지방족 BMAP-18-FL 모두 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 특히 메티실린 내성 황색포도상구균（MRSA）과 다제내성 녹농균（MDRPA）에 대해 동등하게 강력한 항균 활성을 나타냈습니다. SYTOX 녹색 흡수, DNA 결합 및 FACScan 분석을 사용한 작용 기전 조사 결과, 두 펩타이드 모두 막 투과성 및 후속 세포 내 표적화를 유도하여 작용하는 것으로 나타났습니다. 또한 BMAP-18과 BMAP-18-FL 모두 효과적으로 바이오필름 형성을 방지하고 기존 MRSA 및 MDRPA의 바이오필름을 박멸했습니다. 특히 BMAP-18-FL은 BMAP-18에 비해 우수한 항염증 활성을 나타내어 지질다당으로 자극된 대식세포에서 친염증성 사이토카인의 발현 수준을 크게 감소시켰습니다. 이 연구는 방향족 BMAP-18과 지방족 BMAP-18-FL 간의 항균, 항바이오필름 및 항염증 특성의 유사점과 차이점을 강조하여 약물 내성 박테리아에 대한 다기능 항균 펩타이드 개발에 귀중한 인사이트를 제공합니다.

PART II
다제내성（MDR） 박테리아의 증가는 광범위한 활성과 최소한의 숙주 독성을 결합한 새로운 항균제를 요구합니다. 네 가지 짧은 양이온 펩타이드: RL-12, RF-12, KL-12, KF-12는 방향족 대 지방족 소수성 잔기와 구아니디늄（Arg） 대 1차 아민（Lys） 양이온 그룹이 항균 기능을 어떻게 조절하는지 분석하기 위해 설계되었습니다. 나선형 바퀴 투영과 원평광 이색성 스펙트럼은 모든 펩타이드가 막 모방 환경에서 양친매 나선형 구조를 채택한다는 것을 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고, 아르기닌이 풍부한 RL-12와 RF-12는 그람 양성, 그람 음성, 약물 내성 균주에 대해 라이신이 풍부한 KL-12와 KF-12보다 현저히 낮은 최소 억제 농도（MIC）를 나타냈습니다. RL-12와 RF-12는 또한 다제내성 녹농균 생물막의 우수한 억제 및 박멸을 보였으며, 이는 N-페닐-1-나프틸아민（NPN） 흡수, 칼세인 누출 및 프로피듐 아이오다이드 유세포 분석에서 입증되었습니다. 높은 항균 효능에도 불구하고, 아르기닌 기반 펩타이드는 대식세포와 미세아교세포에 대해 허용 가능한 세포 적합성을 유지한 반면, KF-12는 가장 넓은 안전성 차이를 보였습니다. 모든 펩타이드는 지질다당류에 의해 유도된 TNF-α, IL-6, 일산화질소 생성을 약화시켰으며, 류신 함유 유사체는 가장 균형 잡힌 항염증 프로파일을 보였습니다. 중요한 점은, 이 연구는 호모폴리머 서열이 지방족, 방향족, 구아니디늄, 아민 화학의 이질적 혼합물을 통해 놀라운 균형을 이루는 천연 숙주 방어 펩타이드의 세포 적합성 다기능 프로파일을 요약할 수 없음을 보여줍니다. 이러한 결과는 향상된 선택성을 가진 차세대 항균 펩타이드에 대한 합리적인 설계 원칙을 제공합니다.

PART III
거대 원형질막 소포체（GPMV）는 천연 원형질막의 지질 조성과 측면 조직을 보존하는 세포 유래 모델 시스템으로, 막 상 분리 및 단백질 분할을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 연구에서는 BV 2 마이크로아교세포와 RAW 264.7 대식세포에서 GPMV를 생성하여, 기저 조건과 지질다당류（LPS） 자극 후 패턴 인식 수용체인 톨라이크 수용체 4（TLR4）와 CD14가 Lo 도메인과 Ld 도메인 사이에 어떻게 분포하는지 조사했습니다. 상 분리는 Lo 마커 CTxB와 Ld 염료인 DiO/DiI/DiD를 사용하여 시각화되었으며, 이는 두 세포 유형 모두에서 견고하고 상보적인 분할을 보여주며 명확한 도메인 형성을 확인했습니다. Alexa Fluor 488로 라벨링된 TLR4는 RAW 264.7의 막에서 검출 가능했지만, LPS 2는 GM1이 풍부한（Lo） 또는 DiO/DiD가 풍부한（Ld） 영역에서 강한 농축을 보이지 않았으며, 이는 현재 조건에서 TLR4가 엄격하게 제한되거나 뗏목이 아닌 수용체로 기능하기보다는 두 단계를 모두 샘플링함을 시사합니다. 반면, BV 2 GPMV의 CD14 형광은 약하거나 검출되지 않아 도메인 선호도를 신뢰할 수 있게 평가할 수 없었습니다. 이러한 발견은 염증성 세포주에서 나오는 GPMV가 뗏목-비뗏목 조직을 시각화하는 데 유용한 플랫폼을 제공하며, 이는 LPS 유도 신호 동안 TLR4와 CD14 분할의 미묘한 변화를 정량적으로 해결하기 위해 자극 및 라벨링 프로토콜의 추가 최적화가 필요함을 시사합니다.

목차 (Table of Contents)

• PART I Multifunctional Properties of BMAP-18 and Its Aliphatic Analog against Drug-Resistant Bacteria 1
• 1. INTRODUCTION 2
• 2. MATERIALS AND METHODS 5
• 3. RESULTS AND DISCUSSION 12
• 3.1 Peptide Design and Characterization 12
• 3.2 Antibacterial Activity 13
• 3.3 Mechanism of Antibacterial Action 13
• 3.4 Antibiofilm Activity 14
• 3.5 Cytotoxic Activity of Peptides 15
• 3.6 Anti-Inflammatory Activity 15
• 4. DISCUSSION 17
• 5. CONCLUSION 20
• REFERENCE 30
• PART II Unraveling the Dual Roles of Aromatic Hydrophobicity and Guanidinium Cationicity in Optimizing Short Antimicrobial Peptide 37
• 1. INTRODUCTION 38
• 2. MATERIALS AND METHODS 40
• 3. RESULTS 45
• 3.1 Peptide Design and Secondary Structure 45
• 3.2 Antimicrobial Activity and Therapeutic Index 46
• 3.3 Membrane Interaction and Mechanism of Action 47
• 3.4 Anti-biofilm activity 48
• 3.5 Cytotoxicity Against Mammalian Cell Lines 49
• 3.6 Anti-inflammatory Activity 50
• 4. DISCUSSION 52
• 5. CONCLUSION 55
• REFERENCE 66
• PART III Investigation of Lipid Raft Domain Organization and Receptor Localization in Inflammatory Cells using Giant Plasma Membrane Vesicles （GPMVs） 71
• 1. INTRODUCTION 72
• 2. MATERIALS AND METHODS 75
• 3. RESULTS 79
• 3.1 Successful GPMV Generation from BV-2 and RAW 264. 7 Cells 79
• 3.2 Macroscopic Lo/Ld Phase Separation in GPMVs 79
• 3.3 TLR4 Localization in GPMV Membranes 80
• 3.4 CD14 Detection in BV-2-Derived GPMVs 81
• 3.5 Effect of LPS Stimulation on GPMVs 81
• 4. DISCUSSION 84
• 5. CONCLUSION 89
• REFERENCE 96