Melatonin Restores Early Porcine Embryonic Development through SEC62 Mediated ER-phagy and ATF5 Signaling under OTA Induced ER Stress = OTA 유도 소포체 스트레스에 의한 SEC62 매개 ER-phagy 및 ATF5 신호 전달 체계에서 돼지 초기배 발달 회복에 따른 멜라토닌의 효과

국문 초록 (Abstract)

오크라톡신 A（OTA）는 여성 생식 기능 장애와 관련된 식품 유래 곰팡이 독소입니다. 그러나 돼지 배아의 체외배양 중 OTA에 의한 배아 독성 유발 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구는 초기 OTA 노출이 소포체 스트레스 및 SEC62 매개 ER 품질 관리 기전을 통해 돼지 배아의 착상 전 발달을 저해하는지, 그리고 노출 후 멜라토닌 투여가 이러한 유해한 영향을 완화할 수 있는지를 조사하였다. 돼지 배아를 체외배양 초기 48시간 동안 0.5 μM OTA에 노출시킨 후, 맬라토닌을 첨가하였다. 이전 연구에서 OTA가 처리 농도 의존적으로 분열률과 배반포 형성률을 유의하게 감소시키고, 배반포에서 멜라토닌 수치를 감소시키고 세포 사멸을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 OTA 전처리 후 멜라토닌 처리가 돼지 체외수정 배아의 배반포 단계 도달 능력을 부분적으로 회복시키고 배반포의 질을 향상시킨다는 것을 확인하였다. OTA에 노출된 배반포는 GRP78 발현 증가, eIF2α 인산화 증가, 그리고 핵 내 ATF5 국소화를 포함한 ATF5 축적의 현저한 증가를 보였으며, 이는 PERK 관련 통합 스트레스 반응 신호 전달 경로의 활성화를 보여주었다. 특히, OTA는 SEC62 발현과 ER-Tracker 강도를 감소시키는 반면, LC3B 신호는 증가시켰다. OTA에 노출된 배아에서 멜라토닌을 첨가하면 OTA로 인한 ER 스트레스가 감소하고 SEC62로 유도된 ER-phagy 활성이 회복되는 것으로 확인되었다. 종합적으로 이러한 연구 결과는 OTA가 PERK-eIF2α-ATF5로 연결되는 신호전달경로 활성화 및 SEC62 관련 ER 품질 관리 메커니즘 교란을 통해 돼지 배아 발달을 저해하는 반면, 멜라토닌은 세포 항상성을 회복시키고 이러한 부작용을 완화 시킨다는 것을 시사한다. 따라서 본 연구에서는 돼지 초기배를 OTA에 노출 후 멜라토닌의 보충으로 체외배양 동안 OTA로 유발된 발달 결함을 완화하고 배반포 품질을 회복시킨다는 것을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Ochratoxin A （OTA） is a food-derived fungal toxin associated with female reproductive dysfunction. However, the mechanism of OTA induced embryotoxicity during porcine embryos in vitro culture （IVC） has not yet been clearly elucidated. This study investigated whether early OTA exposure impairs preimplantation development in porcine embryos through endoplasmic reticulum （ER） stress and SEC62 preprotein translocation factor （SEC62） mediated ER quality control mechanisms, and whether post exposure melatonin （MEL） treatment can mitigate these detrimental effects. Porcine embryos were exposed to 0.5 μM OTA during the first 48 h of IVC, followed by MEL administration during the later culture period. In our previous study, we confirmed that OTA significantly decreased the cleavage rate and blastocyst formation rate in a treatment concentration dependent manner, while also decreasing MEL levels and increasing apoptosis in blastocysts. In this study, MEL treatment after OTA pretreatment partially restored the developmental ability of porcine in vitro fertilized （IVF） embryos to reach the blastocyst stage and improved blastocyst quality. Blastocysts exposed to OTA showed increased GRP78 expression, enhanced eIF2α phosphorylation, and a marked increase in activating transcription factor 5 （ATF5） accumulation, including increased nuclear ATF5 localization, suggesting activation of the PERK related integrated stress response signaling pathway. In particular, OTA decreased SEC62 expression and ER-Tracker intensity, whereas it increased LC3B signal. In OTA exposed embryos, the addition of MEL was confirmed to reduce OTA derived ER stress and restore the activity of SEC62 derived ER-phagy. Collectively, these findings indicate that OTA impairs porcine embryonic development through activation of the PERK-eIF2α-ATF5 signaling pathway and disruption of SEC62 associated ER quality control mechanisms, while MEL restores cellular homeostasis and alleviates these adverse effects. Therefore, post exposure MEL supplementation alleviates OTA induced developmental defects and improves blastocyst quality during IVC.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 5
• 1. Chemicals and Animals 5
• 2. In vitro maturation （IVM） 5
• 3. In vitro fertilization （IVF） and （IVC） 6
• 4. Treatment conditions 7
• 5. Melatonin ELISA assay 7
• 6. RNA sequencing （RNA-seq） analysis 8
• 7. TUNEL assay 8
• 8. ER-TrackerTM and Lyso-TrackerTM staining 9
• 9. Immunofluorescence （IF） staining 9
• 10. Western blot analysis 10
• 11. Statistical analysis 11
• Ⅲ. RESULTS 12
• 1. OTA induces stress related transcriptomic changes during early porcine embryonic development 12
• 2. OTA impairs blastocyst development and quality in porcine embryos 14
• 3. OTA activates PERK–eIF2α signaling and increases ATF5 expression in porcine blastocysts 17
• 4. OTA disrupts SEC62 mediated ER-phagy in porcine blastocysts 19
• 5. MEL restores blastocyst development and quality in OTA treated porcine embryos 21
• 6. MEL attenuates OTA induced ER stress and restores SEC62 mediated ER-phagy in porcine blastocysts 24
• Ⅳ. DISCUSSION 27
• REFERENCES 31
• ABSTRACT 36