Transcriptional responses of 14-3-3 genes in Sebastes schlegelii to thermal stress and pathogen infection

국문 초록 (Abstract)

14-3-3 단백질은 인산화된 표적 단백질과의 상호작용을 통해 다양한 세포 신호전달, 세포주기 조절, 세포사멸 및 면역반응 등 다양한 생리적 과정에 관여하는 진화적으로 보존된 조절 단백질이다. 그러나, 조피볼락（Sebastes schlegelii）에서 14-3-3 유전자들의 분자적 특성과 환경 스트레스 및 병원체 감염에 대한 전사 반응은 아직 충분히 규명되지 않았다. 이에 본 연구에서는 조피볼락 14-3-3 동형 유전자인 Ss14-3-3ε 및 Ss14-3-3β/α를 동정하고, 생물정보학적 분석과 구조 예측을 수행하였으며, 조직별 발현 특성과 고수온 스트레스 및 병원체 감염에 따른 전사 반응을 분석하였다. Ss14-3-3ε 및 Ss14-3-3β/α의 전장 cDNA 는 각각 1,905 bp 와 2,352 bp 였으며, 각각 259 개와 274 개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하는 것으로 예측되었다. 두 단백질 모두 주로 세포질에 존재하는 것으로 예측되었으며, 다중 서열 정렬 결과 인산화 펩타이드 인식, 결합 방향 유지 및 동종이량체 형성에 필요한 주요 보존 잔기를 공유하였다. 반면, C-말단 영역에서는 뚜렷한 서열 차이가 확인되었다. 계통수 분석에서는 Ss14-3-3ε는 ε 동형 단백질군에 속하였으며, Ss14-3- 3β/α는 Gasterosteus aculeatus 의 14-3-3β/α와 가장 가까운 계통학적 관계를 나타내었다. 또한 AlphaFold 3 기반 구조 예측 결과, 두 단백질 모두 14-3-3 단백질의 전형적인 α-나선 다발 구조와 동종이량체를 형성하는 것으로 예측되었으며, Ss14-3-3β/α는 C-말단 영역에 추가적인 α-나선 구조를 가진 것으로 나타났다. 조직별 유전자 발현 분석 결과, 두 전사체는 조사된 모든 조직에서 발현되었으나 조직별 발현 양상에는 차이가 있었다. Ss14-3-3ε는 간에서 가장 높은 발현 수준을 보인 반면, Ss14-3-3β/α는 아가미에서 가장 높은 발현 수준을 나타내었다. 고수온 스트레스에서는 Ss14-3-3β/α의 발현이 아가미에서 처리 후 24 시간, 간에서는 처리 후 96 시간에 유의하게 증가하였으나, Ss14-3-3ε는 두 조직 모두에서 유의한 발현 변화를 나타내지 않았다. 반면, Vibrio ordalii 감염 후에는 Ss14-3-3ε의 발현이 간에서 감염 후 48 시간에 유의하게 증가한 반면, Ss14-3-3β/α는 아가미와 간 모두에서 유의한 전사 반응을 나타내지 않았다. 이러한 결과들은 Ss14-3-3ε와 Ss14-3-3β/α가 14-3-3 계열의 보존된 구조적 특성을 유지하면서도 서로 다른 조직 특이적 발현 양상과 자극 의존적 전사 반응을 나타냄으로써 기능적으로 분화되어 있을 가능성을 시사한다. 또한 본 연구는 조피볼락 14-3-3 유전자들의 분자적 특성과 환경 스트레스 및 병원체 감염에 대한 전사 조절 특성을 규명함으로써, 어류의 스트레스 적응 및 면역반응 기전을 이해하기 위한 기초자료를 제공하고 향후 14-3-3 단백질의 기능 규명 연구를 위한 기반을 마련할 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

14-3-3 proteins are evolutionarily conserved regulatory molecules that participate in diverse intracellular signaling pathways through interactions with phosphorylated target proteins. However, the molecular characteristics and stress-responsive regulation of 14-3-3 isoforms remain poorly understood in Korean black rockfish （Sebastes schlegelii）. In this study, two 14-3-3 isoforms, Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α, were identified and characterized, and their molecular features, tissue distribution, and transcriptional responses to high-temperature stress and Vibrio ordalii infection were investigated.
The full-length cDNAs of Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α were 1,905 bp and 2,352 bp, encoding predicted proteins of 259 and 274 amino acids, respectively. Both proteins were predicted to be predominantly localized in the cytoplasm and retained the conserved residues required for phosphopeptide recognition, phosphopeptide-binding orientation, and homodimer stabilization. Sequence analysis revealed conserved core helical regions but distinct sequence variation in the C-terminal region. Phylogenetic analysis placed Ss14-3-3ε within the vertebrate ε isoform group, whereas Ss14-3-3β/α formed a distinct branch within the β/α lineage. AlphaFold 3 predicted that both proteins adopted the canonical 14-3-3 homodimeric structure, although Ss14-3-3β/α possessed an extended C-terminal region containing an additional predicted α-helical segment.
Both transcripts were detected in all examined tissues but exhibited distinct tissue-specific expression patterns. Ss14-3-3ε showed the highest basal expression in the liver, whereas Ss14-3-3β/α was most highly expressed in the gill. Under high-temperature stress, Ss14-3-3β/α exhibited a transient increase in the gill at 24 h and a significant increase in the liver at 96 h, whereas Ss14-3-3ε showed no significant transcriptional changes in either tissue. Following Vibrio ordalii infection, Ss14-3-3ε expression was significantly upregulated in the liver at 48 h post-infection, whereas Ss14-3-3β/α showed no significant response in either the gill or liver.
These findings demonstrate that Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α retain the conserved structural framework of the 14-3-3 protein family while exhibiting distinct tissue-specific expression patterns and stimulus-dependent transcriptional regulation. The differential responses of the two isoforms suggest functional divergence in environmental stress adaptation and host defense, providing a molecular basis for future studies on the physiological roles of 14-3-3 proteins in S. schlegelii.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• II. Materials and Methods 6
• 1. Experimental animals and sample collection 6
• 1.1. Experimental animals 6
• 1.2. Sample collection 7
• 2. Stress challenge experiments 7
• 2.1. High-temperature stress treatment 7
• 2.2. Vibrio ordalii infection 8
• 3. Total RNA extraction, cDNA synthesis and gene cloning 8
• 3.1. Total RNA extraction and cDNA synthesis 8
• 3.2. Cloning of full-length Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α cDNAs 9
• 4. Bioinformatic and evolutionary analyses 11
• 4.1. In silico sequence characterization 11
• 4.2. Multiple sequence alignment and pairwise sequence comparison 12
• 4.3. Molecular phylogenetic analysis 13
• 4.4. Homodimeric 3D structure prediction 13
• 5. Gene expression analyses 14
• 5.1. Primer design and RT-qPCR conditions 14
• 5.2. Tissue distribution analysis 15
• 5.3. Expression analysis under high-temperature stress and after V. ordalii infection 15
• 6. Statistical analysis 16
• III. Results 20
• 1. Molecular characterization of Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α 20
• 1.1. Full-length cDNA characterization of Ss14-3-3ε 20
• 1.2. Full-length cDNA characterization of Ss14-3-3β/α 20
• 2. Sequence conservation analysis of Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α 24
• 2.1. Multiple sequence alignment of Ss14-3-3ε 24
• 2.2. Multiple sequence alignment of Ss14-3-3β/α 25
• 2.3. Sequence comparison between Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α 26
• 3. Phylogenetic analysis of Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α 30
• 3.1. Phylogenetic relationship of Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α within vertebrate 14-3-3 isoforms 30
• 4. Structural analysis of Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α 32
• 4.1. Reliability of predicted homodimeric 3D structures 32
• 4.2. Homodimeric 3D structure of Ss14-3-3ε 32
• 4.3. Homodimeric 3D structure of Ss14-3-3β/α 33
• 5. Tissue distribution of Ss14-3-3ε and Ss14-3-3β/α 36
• 5.1. Tissue distribution of Ss14-3-3ε 36
• 5.2. Tissue distribution of Ss14-3-3β/α 36
• 6. Transcriptional responses under high-temperature stress 39
• 6.1. Transcriptional response of Ss14-3-3ε under high-temperature stress 39
• 6.2. Transcriptional response of Ss14-3-3β/α under high-temperature stress 39
• 7. Transcriptional responses after V. ordalii infection 43
• 7.1. Transcriptional response of Ss14-3-3ε after V. ordalii infection 43
• 7.2. Transcriptional response of Ss14-3-3β/α after V. ordalii infection 43
• IV. Discussion 46
• Abstract (English) 52
• References 54
• Acknowledgement 61