Establishment of DGF cell line and its application in investigating apoptosis regulation and exosome-mediated modulation of Megalocytivirus （RSIV and ISKNV） infection|RISS 상세보기

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 관상어류인 드워프구라미 （Dwarf gourami, Trichogaster lalius）의 꼬리지느러미 조직으로부터 유래한 새로운 세포주인 DGF （Dwarf Gourami Fin） 세포를 확립하고, 이를 이용하여 Megalocytivirus 속의 주요 어류 병원체인 red sea bream iridovirus （RSIV）와 infectious spleen and kidney necrosis virus （ISKNV）의 감염 특성을 분석하였다. 더 나아가, 어류의 혈청 및 혈청 유래 엑소좀이 바이러스 감염 확산에 미치는 영향을 규명하였다. Chapter 1에서는 DGF 세포를 확립하고 다양한 어류 바이러스에 대한 감수성을 평가하였다. DGF 세포는 15% FBS를 첨가한 L-15 배지에서 25–30°C에서 배양되었으며, 상피세포 유사 형태를 보이며 100회 이상 안정적으로 계대배양되었다. 바이러스 감수성 평가 결과, DGF 세포는 RSIV와 ISKNV에 대해 높은 감수성을 나타내었으며, Rhabdovirus인 VHSV, HIRRV, SVCV에도 감수성이 있는 것으로 확인되었다. 특히 RSIV와 ISKNV는 DGF 세포에서 각각 1.54 × 1010 genome copies/mL （108.74 TCID50/mL）, 5.22 × 109 genome copies/mL （108.48 TCID50/mL）의 높은 역가를 보였으며, 이는 기존 연구에 활용된 GF, PMF 및 RBF 세포주와 비교하여 동등하거나 더 높은 수준이었다. 세포병변효과 （CPE）의 경우, RSIV 감염군에서는 비대세포 형성과 함께 급격한 단층 파괴가 나타난 반면, ISKNV 감염군에서는 비대세포가 형성됨에도 불구하고 세포 단층이 유지되며 지속적인 바이러스 증식이 이루어지는 차이점을 보였다. 이러한 결과는 DGF 세포가 다양한 어류 바이러스에 대해 높은 감수성을 가지며, 바이러스 분리 및 증식 연구를 위한 유용한 in vitro 모델임을 시사한다. Chapter 2에서는 RSIV와 ISKNV 감염에 따른 증식 패턴과 세포사멸 조절 기전을 비교하였다. RSIV와 ISKNV는 감염 96시간에서 각각 2.71 × 1010 genome copies/mL, 1.60 × 109 genome copies/mL을 나타내어, RSIV가 감염 초기 단계부터 높은 증식률을 보이며 숙주 세포의 빠른 손상을 유도함을 확인하였다. 반면, ISKNV는 상대적으로 낮은 역가와 완만한 비대세포 형성 양상을 보이며 단층이 완전히 파괴되지 않았다. 세포사멸 유전자 발현, Caspase-3 활성 및 미토콘드리아 막전위 변화를 분석한 결과, RSIV 감염은 세포사멸 유도 유전자의 시간 의존적 상향 조절과 미토콘드리아 탈분극을 포함한 뚜렷한 세포사멸 반응을 유도하였다. 반면, ISKNV 감염 세포는 Bax 대비 Bcl-xL의 발현이 지속적으로 높게 유지되는 안정적인 패턴을 보였으며, 이는 감염 전반에 걸쳐 항세포사멸 균형이 유지됨을 시사한다. 이러한 결과는 RSIV와 ISKNV가 서로 다른 세포사멸 조절 전략을 활용함을 보여준다. Chapter 3에서는 어류 혈청 및 혈청 유래 엑소좀이 바이러스 감염에 미치는 기능적 영향을 분석하였다. 돌돔 및 감성돔의 혈청（0.5%）을 첨가하였을 때, 세포 증식 촉진과 더불어 matrix-like 구조로의 세포 이주 및 증식이 확인되었으며, RSIV와 ISKNV의 증식은 혈청 비첨가군 대비 각각 3.86–5.41배, 6.21–7.00배 증가하였다. 반면, 동일 혈청에서 분리한 엑소좀만을 처리한 경우, 세포 증식에는 큰 변화가 없었으나 두 바이러스의 증식은 각각 RSIV에서 0.37–0.44배, ISKNV에서 0.23–0.35배로 감소하였다. 단백질체 분석 결과, 엑소좀 내에는 보체 단백질, 응고 관련 단백질, 지질 대사 관련 단백질 등 다양한 기능적 단백질들이 확인되었으며, 이는 엑소좀 내 cargo가 숙주의 면역 반응과 세포 환경을 복합적으로 조절함으로써 바이러스 증식에 영향을 미침을 시사한다. 본 연구를 통해 확립된 DGF 세포주는 Megalocytivirus 연구를 위한 효율적인 실험 모델로 활용될 수 있으며, RSIV와 ISKNV의 상이한 감염 전략 및 혈청 엑소좀의 역할을 규명한 본 결과는 향후 어류 바이러스 감염 기전 연구 및 제어 전략 수립에 중요한 학술적 기반을 제공한다. Chapter I. Development of Dwarf gourami （Trichogaster lalius） fin derived cell line and its susceptibility to fish virus 1. Introduction The ornamental fish industry has emerged as a rapidly expanding sector within the global aquatic animal trade, largely driven by the increasing popularity of household and public aquaria worldwide （Olivier et al., 2003）. Currently, the ornamental fish trade represents a multibillion-dollar industry involving more than 125 countries, with an estimated annual trade exceeding two billion live fish （Raja et al., 2019）. Despite its substantial economic value and continued growth, the movement of live ornamental fish across international borders has been accompanied by the transmission of various aquatic pathogens. Among these, infectious spleen and kidney necrosis virus （ISKNV） has been frequently detected in ornamental fish species. ISKNV infections have been reported in a wide range of ornamental fishes, including pearl gourami （Trichopodus leerii）, moonlight gourami （Trichopodus microlepis）, dwarf gourami （Trichogaster lalius）, southern platyfish （Xiphophorus maculatus）, green swordtail （Xiphophorus helleri）, molly （Poecilia sphenops）, guppy （Poecilia reticulatus）, oscar （Astronotus ocellatus）, neon tetra （Hyphessobrycon innesi）, and angelfish （P terophyllum eimekei）（Johan et al., 2020）.

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본 연구는 관상어류인 드워프구라미 （Dwarf gourami, Trichogaster lalius）의 꼬리지느러미 조직으로부터 유래한 새로운 세포주인 DGF （Dwarf Gourami Fin） 세포를 확립하고, 이를 이용하여 Megalocytivirus...

목차 (Table of Contents)

Chapter I. Development of Dwarf gourami (Trichogaster lalius) fin derived cell line and its susceptibility to fish virus 1
1. Introduction 1
2. Materials and Methods 5
2.1. Primary culture and subculture of dwarf gourami fin cells 5
2.2. Cell growth optimization 8

Chapter I. Development of Dwarf gourami (Trichogaster lalius) fin derived cell line and its susceptibility to fish virus 1
1. Introduction 1
2. Materials and Methods 5
2.1. Primary culture and subculture of dwarf gourami fin cells 5
2.2. Cell growth optimization 8
2.3. Chromosome analysis 9
2.4. Species confirmation of DGF cells 10
2.5. Transfection of GFP vector 11
2.6. Propagation of viruses 12
2.6.1. Virus susceptibility and viral multiplication 12
2.6.2. Transmission electron microscopy 14
2.7 Characteristics of RSIV and ISKNV replication in DGF cells 15
2.7.1 Extracellular virus propagated in DGF cells 15
2.7.2 Comparison of DGF and other cell lines for megalocytivirus propagation 16
2.7.3. Viral gene expression 17
3. Results 19
3.1. Development of DGF cells 19
3.2 Species confirmation of DGF cells 21
3.3 Chromosome number 23
3.4 Growth characteristics of DGF cells 25
3.5. DGF cell transfection 27
3.6. Virus susceptibility 29
3.7. Viral multiplication 32
3.8. Propagation of RSIV and ISKNV 34
3.9. Comparison of DGF and other cell lines for RSIV and ISKNV propagation 36
3.10. Viral gene expression 39
4. Discussion 41
Chapter II. Comparative analysis of replication kinetics and apoptosis regulation of RSIV and ISKNV in DGF cells 48
1. Introduction 48
2. Materials and Methods 52
2.1. Cell and virus strains 52
2.2. Extracellular propagation of RSIV and ISKNV in DGF cell 53
2.3. Cell viability assay following RSIV and ISKNV infection 54
2.4. Viral gene and apoptosis related gene expression 55
2.5. Caspase-3 activity assay 57
2.6. Mitochondrial membrane potential (ΔΨm) 58
2.7. DNA fragmentation analysis 59
2.8. Evaluation of cell viability and viral replication under cisplatin treatment 60
3. Results 62
3.1. Cytopathic effects and cell viability induced by RSIV and ISKNV 62
3.2. Replication kinetics of RSIV and ISKNV in DGF cells 66
3.3. Expression of apoptosis-related genes in RSIV- and ISKNV-infected DGF cells 68
3.4 Temporal imbalance between Bax and Bcl-xL expression during RSIV and ISKNV infection 71
3.5 Caspase-3 activity analysis 75
3.6 Changes in mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in DGF cells following RSIV and ISKNV infection 77
3.7 DNA fragmentation during viral infection 82
3.8 Effects of cisplatin treatment on DGF cell viability and virus-induced cytopathic changes 84
3.9 Effects of cisplatin treatment on viral replication and MCP gene expression 87
4. Discussion 89
Chapter III. Effects of fish serum and serum-derived exosomes on viral replication and immune responses in DGF cells 103
1. Introduction 103
2. Materials and Methods 107
2.1. Cell and virus strains 107
2.2. Serum collection and exosome isolation 108
2.3. Characterization of isolated exosomes 109
2.4. Effects of fish serum on viral replication 110
2.5 Cell proliferation following exosome treatment 112
2.6 Effect of exosome treatment on viral replication 113
2.7 Viral gene and immune gene expression in exosome-treated DGF cells 114
2.8 Proteomics analysis of RB-Exo and BSB-Exo 116
2.8.1 Proteomic sample preparation and LC-MS/MS analysis 116
2.8.2 Proteomic data processing and functional analysis 118
3. Results 119
3.1. Size distribution and concentration of isolated exosomes 119
3.2 Morphological changes following fish serum supplementation 123
3.3 Effects of fish serum on RSIV and ISKNV replication 125
3.4 Effects of fish serum-derived exosome on cell proliferation 128
3.5 Effects of fish serum-derived exosomes on cytopathic changes in RSIV- and ISKNV-infected DGF cells 130
3.6 Effects of RB-Exo and BSB-Exo on RSIV and ISKNV replication 134
3.7 MCP gene expression during RSIV- or ISKNV infection following fish serum derived exosome treatment 137
3.8 Immune gene expression following RSIV or ISKNV infection supplemented with RB-Exo or BSB-Exo 140
3.8.1 RSIV infection following fish serum derived exosome treatment 140
3.8.2 ISKNV infection following fish serum derived exosome treatment 144
3.9 Proteomics of RB-Exo 148
3.10 Proteomics of BSB-Exo 154
4. Discussion 160