Sterol Engineering of mRNA-Lipid Nanoparticles for Modulating Organ-Level Biodistribution and Enhancing Immune Responses = 장기수준 생체분포 조절과 면역반응 증강을 위한 mRNA 지질 나노입자의 스테롤 엔지니어링

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The performance of mRNA-lipid nanoparticles （LNPs） is governed by multicomponent membrane organization, which critically determines their formulation behavior, organ selectivity, and immunological outcomes. However, compared to ionizable lipids, sterols remain a relatively underexplored design axis. In this study, I engineered sterol compositions by replacing cholesterol with a library of nine-bile acid- derived sterols with different hydroxylation patterns and alkyl tail lengths. I systematically mapped how sterol structure governs formulation-level properties and organ-level expression profiles. By integrating physicochemical characterization with all-atom molecular dynamics （MD） simulations, I demonstrated that the experimentally observed formulation behaviors were consistently correlated with MD-derived membrane structural descriptors. These descriptors provide a quantitative evaluation framework for prioritizing sterol chemotypes based on their predicted encapsulation performance and membrane organization. Our findings support the notion that sterol- dependent membrane organization provides a structural basis for formulation properties, including mRNA encapsulation. Moreover, substituting cholesterol with bile acid- derived sterols consistently attenuated hepatic expression and shifted organ-level expression toward spleen-dominant profiles across the tested sterol series. This redistribution preferentially shifts mRNA expression toward lymphoid organs that are central to immune priming and adaptive immune activation. Among bile acid-derived sterols, CA-20 LNPs functionally enhance antigen-specific humoral immunity and elicit antigen-specific cellular immune responses, including improved memory-associated immune features, while maintaining systemic safety. Collectively, these results establish sterol engineering as a powerful design strategy for modulating LNP formulation properties, in vivo fate, and immunological function.

국문 초록 (Abstract)

mRNA 지질 나노입자（Lipid nanoparticle, LNP）의 성능은 다성분 막 조직（membrane organization）에 의해 좌우되며, 이는 제형 특성, 장기 선택성 및 면역학적 결과를 결정하는 핵심 요소이다. 그러나 이온화 지질에 비해 스테롤은 상대적으로 덜 탐구된 설계 요소로 남아 있다. 본 연구에서는 서로 다른 하이드록실 패턴과 알킬 사슬 길이를 갖는 9종의 담즙산 유래 스테롤 라이브러리를 이용하여 콜레스테롤을 대체함으로써 스테롤 조성을 설계하였다. 이를 통해 스테롤 구조가 제형 수준의 물리화학적 특성과 장기 수준의 발현 양상을 어떻게 결정하는지를 체계적으로 규명하였다. 또한 물리화학적 특성 분석과 전원자 수준의 분자동역학（all-atom molecular dynamics） 시뮬레이션을 통합하여, 실험적으로 관찰된 제형 거동이 막 구조 특성 지표와 일관되게 상관됨을 확인하였다. 이러한 지표는 캡슐화 성능과 막 조직 특성을 기반으로 스테롤 구조를 정량적으로 평가하고 우선순위를 결정할 수 있는 기준을 제공한다. 본 연구 결과는 스테롤에 의해 조절되는 막 조직이 mRNA 캡슐화를 포함한 제형 특성의 구조적 기반을 형성함을 시사한다. 더 나아가, 콜레스테롤을 담즙산 유래 스테롤로 대체함으로써 간 발현이 일관되게 감소하고, 장기 수준 발현이 비장 중심으로 전환되는 경향이 확인되었다. 이러한 재분포는 면역 유도 및 적응 면역 활성화에 중요한 림프기관으로 mRNA 발현을 선택적으로 유도하는 결과를 나타낸다. 특히 CA-20 LNP는 항원 특이적 체액성 면역을 향상시키고, 기억 면역 특성을 포함한 세포성 면역 반응을 유도하면서도 전신 안전성을 유지하는 것으로 나타났다. 종합적으로, 본 연구는 스테롤 엔지니어링이 LNP의 제형 특성, 체내 거동 및 면역 기능을 조절할 수 있는 효과적인 설계 전략임을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS ＆ METHODS 6
• Ⅲ. RESULTS ＆ DISCUSSION 27
• Ⅳ. CONCLUSION 108
• Ⅴ. REFERENCES 111
• Ⅵ. 국문 초록 120