Nipah pseudovirus 항바이러스제 연구 : - = Research on Antiviral Agents for the Nipah Pseudovirus

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The recent global pandemic caused by a bat-derived human-infectious coronavirus has underscored the critical need for heightened awareness and research on high-risk pathogens. Among zoonotic viruses with high human infectivity, Nipah virus (NiV) is recognized as one of the eight major infectious diseases posing a serious global health threat. The absence of approved therapeutics or vaccines highlights the urgent need for effective countermeasures. However, NiV research is severely limited due to its requirement for Biosafety Level-4 (BSL-4) containment facilities.
In this study, a Biosafety Level-2 (BSL-2) compatible NiV analog platform was established, enabling safe laboratory research without the need for BSL-4 conditions. Using HEK293T cells, virus-like particles (VLPs) expressing NiV surface glycoproteins together with a green fluorescent protein (GFP) reporter gene were generated, allowing evaluation of viral assembly and infectivity. Particle morphology and biophysical characteristics were assessed via dynamic light scattering (DLS), flow cytometry (FACS), and transmission electron microscopy (TEM).
Furthermore, by integrating antiviral screening with an FDA-approved compound library, we identified potential inhibitors of Nipah pseudovirus entry. Several candidate compounds exhibited significant inhibitory effects on viral entry for up to 72 hours, demonstrating efficacy even at the lowest concentration tested (0.625 µM), suggesting strong antiviral potency. While additional analyses are required to determine the underlying mechanisms, these compounds are presumed to inhibit NiV cell entry by blocking membrane fusion mediated by the F and G glycoproteins.
Overall, the BSL-2 NiV analog platform developed in this study effectively circumvents the limitations of BSL-4 research and provides a valuable tool for safe antiviral screening, infectivity assessment, and mechanism-of-action studies. These findings offer foundational data for the development of novel NiV entry inhibitors and therapeutic strategies, and are expected to facilitate research on high-risk zoonotic viruses.

국문 초록 (Abstract)

박쥐 유래 인간 감염성 코로나바이러스의 세계적 유행 이후, 고위험 병원체에 대한 연구의 중요성이 크게 강조되었다. 그중에서도 높은 인간 감염성을 가진 인수공통바이러스인 니파바이러스(Nipah virus, NiV)는 전 세계적으로 8대 주요 감염병 중 하나로, 승인된 치료제나 백신이 없어 효과적인 대응 체계 구축이 시급하다. 그러나 NiV 연구는 생물안전등급 4 (BSL-4) 시설에서만 수행 가능하다는 제한으로 인해 연구 접근성이 낮고, 항바이러스제 개발 및 기작 연구가 어렵다는 한계가 있다. 이러한 문제를 해결하고자 본 연구에서는 생물안전등급 2 (BSL-2) 조건에서 안전하게 연구할 수 있는 Nipah pseudovirus system을 구축하고, 이를 활용하여 바이러스 entry 억제 후보 약물을 스크리닝하는 것을 목표로 하였다.
기존 pUC 벡터에 존재하던 NiV F 단백질과 G 단백질을 각각 lentivirus 벡터로 클로닝하였으며, 각 벡터에는 GFP 리포터 유전자가 포함되었다. HEK293T 세포를 이용하여 pseudovirus를 생산하고, 생산 효율을 최적화하기 위해 DNA 농도, 형질감염 시간, transfection reagent 및 세포주를 평가하였다. 확보된 pseudovirus는 Dynamic Light Scattering (DLS), Flow cytometry, Transmission Electron Microscopy (TEM)을 통해 입자 특성, 구조 및 감염성을 평가하였으며, 기능적으로 안정적인 Nipah pseudovirus가 확립되었다. 이러한 시스템은 BSL-2 환경에서도 NiV 연구를 안전하고 효율적으로 수행할 수 있는 플랫폼으로, 향후 고위험 인수공통바이러스의 high-throughput 항바이러스 스크리닝에도 활용 가능하다.
항바이러스 후보 약물 선별을 위해 안전성과 신속한 치료 후보 발굴이 가능한 FDA 승인 약물을 활용하였다. 먼저 Vero-E6 세포에서 세포독성 평가를 수행하여 80% 이상의 세포 생존율을 보이는 약물을 1차적으로 선별하였고, 이를 생산된 Nipah pseudovirus에 적용하여 바이러스 진입 억제 활성을 평가하였다. 스크리닝 결과, 후보 약물은 낮은 농도인 0.625 µM에서도 효과적인 진입 억제 효능을 보였으며, 정확한 기작 연구는 향후 추가 연구가 필요하다.
본 연구는 BSL-2 조건에서 수행 가능한 Nipah pseudovirus system을 확립하였으며, 이를 활용한 FDA 승인 약물 기반 항바이러스 스크리닝 전략을 제시하였다. 이러한 접근은 기존 BSL-4 연구의 제약을 극복하며, 신규 항바이러스 후보 발굴을 위한 기초 자료를 제공하고, 향후 감염 세포 모델 및 in vivo 모델에서 후보 화합물의 효능 평가에 활용될 수 있음을 시사한다. 또한, 확립된 플랫폼은 NiV뿐 아니라 기타 고위험 인수공통바이러스 연구에도 적용 가능하며, 신속하고 안전한 항바이러스 연구 환경 구축에 기여할 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• 1-1. Structure of Nipah virus (NiV) 1
• 1-2. Transmission routes of NiV 4
• 1-3. Therapeutics and vaccines for the NiV 6
• 1-4. Limitations of NiV research 9
• Ⅱ. 재료 및 방법 11
• 2-1. Cell lines 11
• 2-2. Subcloning of NiV envelope protein genes 11
• 2-3. Construction of the NiV envelop protein plasmid 11
• 2-3-1. Transformation and DNA isolation for plasmid amplification · 12
• 2-3-2. Restriction enzyme digestion for molecular cloning 12
• 2-3-3. Construction of recombinant plasmid via ligation 13
• 2-3-4. PCR and electrophoresis 13
• 2-4. Production of pseudotyped lentiviruses 16
• 2-5. Pseudovirus purification 16
• 2-6. Dynamic light scattering (DLS) analysis 16
• 2-7. Flow cytometry analysis 17
• 2-8. Transmission electron microscopy (TEM) Analysis 17
• 2-9. Determination of viral infectivity 18
• 2-10. Antiviral screening 18
• 2-10-1. Cytotoxicity assessment of FDA-approved compounds 18
• 2-10-2. Antiviral assay using co-treatment 19
• Ⅲ. 결과 및 고찰 20
• 3-1. Confirmation of cloning of the NiV F and G Genes 20
• 3-2. Verification of insert sequence cloning 24
• 3-3. Production of pseudoviruses 31
• 3-3-1. Optimization of DNA concentration for pseudovirus
• production 31
• 3-3-2. Optimization of transfection reagents and cells 34
• 3-4. Characterization of Nipah pseudovirus 37
• 3-4-1. DLS measurement of Nipah pseudovirus particles 37
• 3-4-2. TEM Nipah pseudovirus particle measurement 39
• 3-5. Assessment of Nipah pseudovirus infectivity 41
• 3-5-1. Establishment and validation of a cell-based pseudovirus in-
• fection model 41
• 3-5-2. Flow cytometric quantification of Nipah pseudovirus
• infection 44
• 3-5-3. Determination of Nipah pseudovirus titer 47
• 3-6. Assessment of cell viability for screening of FDA-approved
• drugs 49
• 3-7. Validation of antiviral efficacy 52
• 3-8. Establishment and validation of a cell-based pseudovirus infection
• model 55
• Ⅳ. 요 약 58
• Ⅴ. 참고문헌 60
• Ⅵ. 영문초록 65