Molecular genetic study of RNF186 variants in ulcerative colitis for the evaluation of disease association and the elucidation of pathophysiological mechanisms = RNF186 유전변이의 궤양성 대장염 질병 연관성 평가 및 병태생리 기전 규명을 위한 분자유전학적 연구

국문 초록 (Abstract)

궤양성 대장염은 유전적 요인과 환경적 요인이 복합적으로 작용하는 만성적이며 특발적인 염증성 장질환으로, 그 발병 원인은 명확히 규명되지 않았다. 최근의 전장유전체연관분석(genome-wide assocaion study) 결과, ring finger protein 186 (RNF186) 유전자가 궤양성 대장염의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 occludin의 유비퀴틴화를 통해 장 항상성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. RNF186 유전자의 두 가지 변이형인 A64T (rs41264113)와 R179X (rs36095412)는 단백질의 구조와 기능에 변화를 초래하는 것으로 보고되었으나, 이들의 병리적 영향에 대해서는 아직 논란이 있다. 한편, GWAS에서 보고된 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)은 RNF186 유전자의 상류에 위치하고 있고, 궤양성 대장염 환자의 대장 생검에서 RNF186 유전자의 발현량이 변화한다는 보고가 있어, 본 연구에서는 궤양성 대장염 환자에서 RNF186 유전자의 A64T, R179X 변이와 함께 근위 프로모터 영역을 분석하여 질병 관련 변이를 규명하고자 하였다.
본 연구에서는 한국인 궤양성 대장염 환자군과 연령 및 성별이 일치하는 대조군으로부터 buffy coat에서 genomic DNA를 추출하였다. RNF186 유전자의A64T 및 R179X 변이와 근위 프로모터 영역을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)으로 증폭한 후, amplicon sequencing을 통해 염기서열 분석을 수행하였다. 환자군과 대조군 간의 유전자형 및 대립유전자 빈도를 비교하고, SPSS 통계 프로그램을 이용하여 RNF186 유전자 변이와 궤양성 대장염 간의 연관성을 평가하였다. 또한, 1000 Genomes Project 데이터베이스로부터 동아시아 및 남아시아 집단의 A64T와 R179X 변이 정보를 수집하여 변이의 인종 간 분포 차이 및 질병 감수성과의 연관성을 추가적으로 분석하였다. RNF186 프로모터 영역 내 전사인자 결합 가능성은 PROMO 프로그램을 이용하여 예측하였으며, rs12064796 SNP의 대립유전자에 따른 transcriptional efficiency는 dual luciferase reporter assay로 평가하였다.
연관성 분석 결과, RNF186 유전자의 A64T 변이는 한국인 궤양성 대장염 환자에서 관찰된 반면, R179X 변이는 관찰되지 않았다. 또한, A64T 변이의 분포는 한국인 궤양성 대장염 환자군과 동아시아 및 남아시아 집단 간에서 유의미한 차이를 보였다. 아울러 RNF186 프로모터 영역의 c.–326C>T (rs12064796) 단일염기다형성이 전사인자 결합 친화도 및 전사 효율을 조절함으로써 궤양성 대장염의 감수성과 연관됨을 확인하였다.
이상의 결과를 종합할 때, 본 연구는 한국인 궤양성 대장염 환자에서 RNF186 유전자의 생식세포 변이와 조절 영역 SNP를 동시에 보고한 최초의 연구로서 학문적 의의를 지닌다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods 5
• 1. Blood samples 5
• 2. Ethical statements 5
• 3. Genomic DNA extraction 6
• 4. Genetic analysis 6
• 5. Genetic information on South and East Asian population 10
• 6. Prediction of transcription factor binding 10
• 7. Cell culture 10
• 8. Plasmids and dual luciferase reporter assay 10
• 9. Statistical analysis 11
• Ⅲ. Results 12
• 1. Identification of a disease-associated germline mutation (A64T) of the ring finger protein 186 gene (RNF186) in Korean patients with ulcerative colitis 12
• 1-1. Study population 12
• 1-2. Identification of the A64T germline mutation in the RNF186 gene in ulcerative colitis patients 12
• 2. A functional promoter SNP in RNF186 gene confers ulcerative colitis susceptibility through altered transcriptional regulation 18
• 2-1. Strong association of the rs12064796 SNP with susceptibility to ulcerative colitis 18
• 2-2. The rs12064796 SNP modulates transcription factor binding affinity and transcriptional activity of the RNF186 gene 22
• Ⅳ. Discussion 29
• Ⅴ. References 35
• 초록 43