Molecular Characterization of a Novel H2N2 Reassortant Influenza A Virus = 신규 H2N2 인플루엔자 A 바이러스 재조합체의 분자적 특성 분석

국문 초록 (Abstract)

조류 인플루엔자 바이러스(AIV)는 야생 수생조류를 주요 자연숙주로 하여 다양한 HA–NA 조합의 유전적 다양성을 유지하며 전 세계적으로 순환하고 있다. 1957년 인체 감염 팬데믹을 유발한 H2N2 아형은 1968년 이후 인간 집단에서 순환하지 않고 있으나, 야생조류에서는 지속적으로 검출되고 있다. 본 연구에서는 2023년 대한민국 천수만에서 채집된 야생조류 분변으로부터 A/aquatic bird/South Korea/EK1/2023 (H2N2) 바이러스를 분리하고, 유전적·항원학적·기능적 특성을 분석하였다.

전장 유전체 분석 결과, A/EK1/2023 (H2N2)의 8개 유전자 분절은 모두 유라시아 조류 계통에 속하였다. HA 유전자는 중국 및 일본의 H2N8 계열과, NA 유전자는 국내 H9N2 계열과 높은 유사성을 보였다. HA 절단부위는 단염기성 서열을 가지며 저병원성 조류 인플루엔자(LPAI)의 특징을 나타냈다. 수용체 결합 부위에서는 Q226 잔기가 유지되었고 G228S 치환이 확인되었다. PB2 E627K 및 D701N 변이는 검출되지 않았으며, M1 N30D 및 T215A 치환이 확인되었다.

A/EK1/2023 (H2N2)는 MDCK 세포에서 증식하였으나, 인간형(α-2,6) 수용체 결합은 미약하였다. 마우스 감염 실험에서는 바이러스 증식, 바이러스 RNA, 항원 검출 및 병리학적 변화가 관찰되지 않았다. MDCK 세포 적응 과정에서 HA 유전자 내 G372V 및 S546C 치환이 관찰되었으며, Swine H1N1과의 co-infection 실험을 통해 재조합 바이러스 후보군이 분리되었다.

본 연구에서 분리된 A/EK1/23 (H2N2)는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스로, 포유류 감염성과 병원성은 제한적인 것으로 나타났다. 세포 적응 과정에서 일부 HA 아미노산 치환이 관찰되었으며, swine H1N1과의 재조합 가능성이 제시되었다. 본 연구는 야생조류 유래 H2 계열 인플루엔자 바이러스의 생물학적 특성을 제시하고, 향후 H2 아형의 재출현 위험 평가를 위한 기초 자료로 활용될 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• 1-1 Literature of thesis 1
• 1-2 Host ranges of influenza A viruses 6
• 1-3 Historical and pandemic significance of the H2N2 subtype 11
• 1-4 Research objectives 14
• Ⅱ. Materials and methods 17
• 2-1 Cell lines 17
• 2-2 Sample collection and virus isolation 17
• 2-3 Genetic analysis 18
• 2-3-1 RNA extraction and cDNA synthesis 18
• 2-3-2 Sanger sequencing analysis 18
• 2-3-3 Phylogenetic analysis 18
• 2-4 Receptor binding assay 20
• 2-5 Determinant of virus titer 20
• 2-5-1 TCID50 assay 20
• 2-5-2 RT-qPCR assay 21
• 2-5-3 Viral growth kinetics 21
• 2-6 Animal expetiment 21
• 2-6-1 Mouse inoculation 21
• 2-6-2 Virus titers in lung 22
• 2-6-3 Histopathological analysis 22
• 2-7 Virus adaption 22
• 2-7-1 Cell culture 22
• 2-7-2 Mouse model 23
• 2-8 Next-generation sequencing (NGS) analysis 23
• 2-9 Protein structure prediction 24
• 2-10 Generation of recombinat viruses 24
• 2-11 Statistical analysis 25
• 2-12 Ethics statement 25
• Ⅲ. Results 26
• 3-1 Genetic chracterization of a novel H2N2 avian influenza virus (AIV) 26
• 3-1-1 Full genome sequencing 26
• 3-1-2 Phylogenetic analysis 26
• 3-1-3 Analysis of molecular markers 39
• 3-2 Growth properties of a novel H2N2 AIV in mamalian cells 41
• 3-2-1 Infectivity of TCID50 and EID50 assay 41
• 3-2-2 Viral growth kinetics 43
• 3-3 Receptor binding preference of a novel H2N2 AIV 45
• 3-4 Growth properties of a novel H2N2 AIV in mice 47
• 3-4-1 Infectivity of TCID50 and RT-qPCR assay 47
• 3-4-2 Histopathological analysis 50
• 3-5 Growth properties of MDCK-adapted H2N2 AIVs 52
• 3-5-1 Infectivity of TCID50 assay 52
• 3-6 Pathogenecity of mouse-adapted H2N2 AIVs 55
• 3-6-1 Infectivity of TCID50 and RT-qPCR assay 55
• 3-6-2 Histopathological analysis 58
• 3-7 NGS-identified substitutions in MDCK-adapted H2N2 AIVs 60
• 3-8 Infectivity of reassortant viruses in mammalian cells 66
• Ⅳ. Discussion 68
• Ⅴ. Summary 72
• Ⅵ. Reference 74
• Abstract 82