Development of Sparassis latifolia-Based Anti-Obesity Candidates : From Crude Extract to Active Constituent (Sparalide B) in Cell-Based Mechanisms = 꽃송이버섯 기반 항비만 후보소재 개발: 조추출물에서유효성분(Sparalide B)까지의 세포기전

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Obesity is a chronic, relapsing disease driven in part by dysregulated adipocyte differentiation and lipid metabolism. Natural products that act directly on adipocytes to limit lipid storage and enhance energy expenditure are of growing interest as complementary anti-obesity strategies. Sparassis latifolia is an edible mushroom containing both polysaccharides and phthalide-class metabolites with reported metabolic benefits in vivo, but the cellular mechanisms underlying its effects on adipocytes have not been fully elucidated. Here, we evaluated the impact of a 30% ethanol extract of S. latifolia (SL30E) and the isolated phthalide sparalide B on adipogenesis and lipid metabolism in 3T3-L1 cells.
SL30E significantly reduced lipid droplet and triglyceride accumulation in differentiated adipocytes in a dose-dependent manner and was more effective than the positive control extract CQR-300, without inducing overt cytotoxicity. Mechanistically, SL30E suppressed early adipogenic programming by downregulating PPARγ and CEBPα and required the early differentiation period to exert its maximal effect. SL30E increased β-catenin levels, and β-catenin knockdown abolished its ability to inhibit adipogenic transcription factors and lipid droplet formation, indicating a β-catenin-dependent anti-adipogenic mechanism. In more mature adipocytes, SL30E also regulated lipolysis, lipophagy, and thermogenesis-related energy metabolism.
Structural analysis of an active small-molecule fraction identified sparalide B (4,5,7-trihydroxy-6-methoxyphthalide) as a key component. Sparalide B alone inhibited lipid droplet formation, suppressed PPARγ and CEBPα, reduced perilipin-1, and activated AMPK, UCP2, and PGC-1α, with early-stage and β-catenin dependence similar to SL30E. Overall, these findings suggest that S. latifolia and sparalide B may be useful candidates for developing anti-obesity strategies that act directly on adipocytes by reducing fat cell formation and promoting fat breakdown and energy use.

국문 초록 (Abstract)

비만은 인체의 대사장애에 의해 조절되지 않은 지방세포 분화와 지질대사 이상에 의해 부분적으로 유발되는 만성 재발성 질환이다. 지방세포에서 지질형성 및 저장을 억제하고 에너지 소비를 증가시키는 천연물은 기존 항비만 치료를 보완할 수 있는 전략으로 관심을 받고 있다. Sparassis latifolia (꽃송이버섯)는 in vivo에서 지질대사에 효과적이라고 보고된 다당 및 phthalide 계열 화합물 함유하고 있지만, 비만에 대한 약리작용 기전은 아직 충분히 규명되지 않은 실정이다. 본 연구에서는 꽃송이버섯 30% EtOH 추출물 (SL30E)과 분리 정제한 phthalide 화합물 sparalide B가 3T3-L1 지방전구세포에서 지질대사에 미치는 영향을 평가하였다.
SL30E는 분화된 3T3-L1 세포에서 지질 방울과 중성지방 축적을 농도 의존적으로 유의하게 감소시켰으며, 세포독성 없이 비만에 효과적이라고 알려져 있는 시서스 추출물 (CQR-300)보다 더 강한 억제 효과를 나타냈다. SL30E는 초기 분화 단계에서 지방형성 관련 핵심인자인 PPARγ와 CEBPα 발현을 감소시켜 초기 지방세포 분화를 억제하였다. 또한 SL30E는 β-catenin 발현을 증가시켰으며, β-catenin siRNA 처리 시 PPARγ와 CEBPα의 억제와 지질 방울 감소 효과가 소실되어 SL30E의 지질형성 억제 효과가 β-catenin 의존적임을 시사하였다. 또한 지방이 형성된 성숙 3T3-L1 cell에서 SL30E는 지방분해, 지방포식 및 열발생 관련 에너지 대사 인자를 함께 조절하여 항비만 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
활성 추적법을 통해 SL30E의 유효성분을 추적하였다. 분리 및 정제결과 SLE-4-5 분획물이 비만억제에 효과적인 활성 성분임을 확인하였으며, 이는 HR-ESI-MS와 HMBC NMR 결과를 통해 분자량과 구조식을 확인하여 sparalide B（4,5,7-trihydroxy-6-methoxyphthalide)임을 증명하였다. Sparalide B 단독 처리 시에도 지질 방울 형성이 농도 의존적으로 억제되었으며, PPARγ와 CEBPα의 억제와 perilipin-1의 발현이 감소하였다. 또한 AMPK 인산화와 UCP2, PGC-1α의 발현 증가는 sparalide B가 지방세포 분화 억제와 함께 에너지 대사·열발생 관련 경로를 활성화함을 시사한다. 특히 Sparalide B의 지방형성 억제효과는 SL30E와 마찬가지로 β-catenin 신호에 의존적이었으며, 초기 분화 단계에서의 작용이 필수적인 것으로 확인되었다. 결론적으로 S. latifolia 30% 에탄올 추출물과 그 phthalide 성분인 sparalide B는 지방세포 수준에서 지방세포 형성과 지방 축적을 억제하고 지방 분해 및 에너지 이용을 촉진하는 항비만 후보 물질로서의 가능성을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Review of Literature 1
• 1. Introduction 12
• 2. Materials and Methods 15
• 3. Results 25
• 3.1. Result I. Anti-obesity Mechanisms of Sparassis latifolia 25
• 3.1.1. Effects of SL on lipid droplet accumulation in differentiated 3T3-L1 cells 26
• 3.1.2. Effects of SL30E on lipid droplet and triglyceride accumulation in differentiated 3T3-L1 cells 28
• 3.1.3. Comparison of the effects of SL30E and CQR-300 on lipid droplet accumulation in differentiated 3T3-L1 cells 30
• 3.1.4. Effects of SL30E on cell number and viability in 3T3-L1 cells 32
• 3.1.5. Effects of SL30E on adipogenic protein expression and lipid accumulation in 3T3-L1 cells 34
• 3.1.6. Effects of SL30E and β-catenin knockdown on β-catenin and adipogenic protein expression in 3T3-L1 cells 36
• 3.1.7. Effects of SL30E on the expression of lipolysis-, autophagy-, and thermogenesis-related proteins in differentiated 3T3-L1 cells 38
• 3.1.8. Effects of SL30E on lipolysis-, lipophagy-, and thermogenesis-related proteins, and glycerol release in differentiated 3T3-L1 cells 40
• 3.2. Result II. Anti-obesity Mechanisms of Sparalide 42
• 3.2.1. HR-ESI-MS chromatography of Sparalide B 43
• 3.2.2. 1H- and 13C-NMR spectra of sparalide B (SLE-4-5) 45
• 3.2.3. Two-dimensional HMBC NMR spectrum and chemical structure of sparalide B (SLE-4-5) 47
• 3.2.4. Effects of sparalide B on lipid droplet accumulation in differentiated 3T3-L1 cells 49
• 3.2.5. Effects of sparalide B on adipogenic-, lipolytic-, and thermogenesis-related protein expression in differentiated 3T3-L1 cells 51
• 3.2.6. Effects of stage-specific sparalide B treatment on lipid droplet accumulation in differentiated 3T3-L1 cells 53
• 3.2.7. Effects of stage-specific sparalide B treatment on adipogenic, lipolytic, and thermogenesis-related protein expression in differentiated 3T3-L1 cells 55
• 3.2.8. Effects of sparalide B and β-catenin knockdown on β-catenin and adipogenic protein expression in 3T3-L1 cells 57
• 3.2.9. Effects of sparalide B and β-catenin knockdown on lipid droplet accumulation in 3T3-L1 cells 59
• 4. Discussion 61
• 5. Conclusion 67
• References 68
• Korean Abstract 74