Seasonal Comparison of Fecal Parasitome of Raccoon Dogs in a Rice Paddy Area of Korea by DNA Metabarcoding = DNA 메타바코딩에 기반한 한국 논 생태계에서의 너구리(Nyctereutes procyonoides) 분변 기생충 군집의 계절적 비교분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Raccoon dogs (Nyctereutes procyonoides) act as reservoirs for various zoonotic parasites. Therefore, monitoring raccoon dogs could be relevant to human health. Although they are opportunistic omnivores whose behavior and diet change seasonally, very few studies have described how their fecal parasitic community varies across seasons. For this reason, this study used DNA metabarcoding, which is well-suited for community-level analysis, to (1) characterize and compare the parasitic communities of raccoon dog feces sampled in spring, summer, autumn, and winter, and (2) identify zoonotic parasites, parasites that can be transmitted from animals to humans.
Methods: In this study, we collected and identified a total of 27 fecal samples from rice paddies in Seosan, Chungcheongnam-do, with six samples in autumn and seven in each of the other seasons. After sample collection, DNA metabarcoding targeting the 18S rRNA gene of nine groups of parasites was conducted. Based on the metabarcoding results, we calculated the relative abundances of the detected zero-radius operational taxonomic units (ZOTUs) and evaluated both within-sample (α) and between-sample (β) diversity, and performed taxonomic assignment for these ZOTUs. To characterize α diversity, we calculated the Chao1 estimator for parasite richness and the Shannon index to reflect both parasite richness and evenness. β diversity, in terms of the similarity in community membership (i.e., presence–absence of detected species) and community structure (i.e., abundance of detected species), was assessed using the Jaccard index and Bray–Curtis dissimilarity, respectively. Taxonomic assignment was performed using NCBI BLAST, and for zoonotic parasites, we additionally conducted neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree analyses.
Results: Diversity analyses showed that for α diversity, such as parasite species richness, there were differences between summer and autumn. For β diversity, except for community membership between spring and summer, both membership and structure differed among all seasonal pairs. Taxonomic assignment results showed that a total of 26 genera belonging to target parasite groups were detected. The highest number of genera was observed in autumn (16 genera), whereas the lowest was observed in winter (12 genera). Three zoonotic parasite species were detected, among which Toxocara cati has not previously been reported in raccoon dogs.
Conclusion: In this study, we used DNA metabarcoding to investigate seasonal changes in the fecal parasitome of raccoon dogs. Parasite community composition varied, particularly in terms of community membership and structure. Also, we detected three parasite species that can cause zoonotic diseases. Taken together, our findings suggest that since zoonotic parasites were detected from raccoon dogs, surveillance of this species could provide insights into its potential impacts on human health. Moreover, given the seasonal variation in their fecal parasitome, such surveillance should not be limited to a single season but should be conducted year-round.

국문 초록 (Abstract)

Background: 너구리(Nyctereutes procyonoides)는 다양한 인수공통감염 기생충의 저장고(reservoir)로 작용한다. 따라서, 너구리에 대한 모니터링은 사람들의 건강과도 연결될 가능성이 있다. 비록 기회주의적 잡식동물인 너구리들이 계절에 따라 행동 양상과 식성을 다르게 가져감에도, 계절의 변화에 따라 너구리의 분변의 기생충 군집(parasitome)이 어떻게 변화하는지를 나타낸 연구는 매우 드물다. 이에 본 연구에서는 군집 수준의 연구에 적합한 DNA 메타바코딩 기법을 이용하여 (1) 봄, 여름, 가을, 겨울에 채집한 너구리 분변의 기생충 군집을 조사 및 비교하고, (2) 동물과 사람 사이에서 전파가 가능한 기생충 종들인 인수공통감염 기생충들을 확인하고자 하였다.
Method: 본 연구에서는 충청남도 서산시의 논에서 봄, 여름, 겨울에 7개, 가을에 6개로 총 27개의 너구리 배설물을 채집하고 너구리 분변임을 확인하였다. 이후 아홉 개의 기생충 군집을 표적으로 하는 DNA 메타바코딩 방법을 적용하였다. 메타바코딩 결과를 바탕으로 검출된 zero-radius operational taxonomic units (ZOTUs)에 대해 상대적 풍부도를 계산하고, 시료 내(α) 및 시료 간(β) 다양성을 평가하였으며, ZOTU들에 대한 분류학적 동정을 수행하였다. α 다양성을 평가하기 위해 기생충의 풍부도를 나타내는 Chao1 richness estimator와 풍부도 및 균등도를 모두 나타내는 Shannon index를 사용하였고, β 다양성을 평가하기 위해 구성(membership)을 나타내는 Jaccard index와 풍부도 기반 구조(structure)를 나타내는 Bray–Curtis dissimilarity를 사용하였다. 분류학적 동정에는 NCBI BLAST를 이용하였고, 인수공통감염 기생충으로 동정된 ZOTU들에 대해서는 추가로 neighbor-joining(NJ) 계통수 분석을 실시하였다.
Results: 다양성에 대해 분석한 결과 α 다양성의 경우 여름과 가을 사이에서 종 풍부도에 대한 차이가 나타났으며, β 다양성의 경우 봄과 여름 사이의 군집 구성에서는 차이가 나타나지 않았으나, 다른 모든 계절 쌍에서 군집의 구성과 구조가 모두 차이를 보였다. 분류학적 동정 결과 총 8개의 기생충 군집에서 26개 속이 검출되었다. 검출된 속의 수는 가을에 16개로 가장 많았으며, 겨울에는 12개로 가장 적었다. 이 가운데 너구리에서 이전에 보고된 적이 없는 Toxocara cati 종을 포함해 총 3종의 인수공통감염 기생충이 검출된 것으로 드러났다.
Conclusion: 본 연구에서는 DNA 메타바코딩을 이용하여 너구리 분변의 기생충 군집이 계절에 따라 어떻게 변화하는지를 조사하였다. 그 결과 너구리 분변에서 주로 구성 및 구조적 측면에서 기생충 군집 조성(composition)이 계절에 따라 달라진 것을 확인하였으며, 세 종의 인수공통감염 기생충을 검출하였다. 종합하면, 너구리에서 인수공통 기생충이 검출되었다는 점에서 본 종에 대한 감시는 사람 건강에 미칠 수 있는 잠재적 영향을 이해하는 데 중요한 정보를 제공할 수 있다. 더 나아가 분변 기생충군집이 계절에 따라 변화한다는 점을 고려할 때, 이러한 감시는 단일 계절에 국한되지 않고 연중 지속적으로 수행되어야 할 필요가 있다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract ⅰ
• Contents ⅳ
• List of Tables ⅴ
• List of Figures ⅵ
• 1. Introduction 1
• 2. Materials and methods 4
• 2.1. Fecal samples 4
• 2.2. DNA extraction 5
• 2.3. DNA sequencing 6
• 2.4. Data processing and analysis 7
• 2.5. Statistical analysis 8
• 3. Results 11
• 3.1. Sequencing statistics 11
• 3.2. Diversity 12
• 3.3. Taxonomic composition 14
• 3.4. Zoonotic parasites 16
• 4. Discussion 22
• 5. Conclusion 27
• References 28
• Supplementary Data 35
• 국문초록 37