Quantitative analysis of the phagocytic behaviors of macrophages in various biochemical/biophysical environments = 다양한 생화학적·생물물리적 환경에서의 대식세포 식세포 작용의 정량적 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Macrophages are scavenger cells responsible for the clearance of pathogens and dying/transformed cells by phagocytosis. They are highly plastic innate immune cells with remarkable heterogeneity: thus, their phagocytic behaviors are likely to vary depending on environmental cues. For example, they may engulf the entire target cells through phagocytosis, but they may acquire portions of target cells via trogocytosis. So far, the phagocytic behaviors of macrophages have been primarily analyzed based on binary criteria, whether they have acquired any fragments of the target cells or not, while comprehensive analysis of trogocytosis has been limited. In this study, we devised a flow cytometry-based method to quantitatively assess detailed phagocytic behaviors of macrophages and applied it to human primary macrophages differentiated in various biochemical/biophysical settings. First, monocytes isolated from the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were differentiated to macrophages by treating them with M-CSF or GM-CSF, and further polarized to M1 or M2 via exposure to LPS/IFN-γ or IL-4, respectively. Then, the morphology, phenotype, and phagocytic behaviors the differentiated and polarized cells were analyzed. The morphology and phagocytic behaviors of macrophages were primarily influenced by types of macrophage differentiation factors, such as M-CSF and GM-CSF, rather than M1/M2 polarization. Macrophages differentiated with M-CSF (M-MFs) exhibited elongated shapes and performed active membrane trogocytosis, whereas macrophages differentiated with GM-CSF (GM-MFs) were rounded and exhibited a significant reduction in overall phagocytic activities in comparison to M-MFs. In addition, macrophages were plated on nanogrooved substrates, which are known to induce cell elongation along the groove direction, and their morphology and phagocytic behavior were assessed to test whether morphology is a key factor regulating phagocytic behaviors.

국문 초록 (Abstract)

대식세포는 포식작용을 통해 병원체를 제거하고, 사멸 중이거나 변형된 세포를 청소하는 포식 세포로 기능한다. 이들은 높은 가소성과 두드러진 이질성을 지닌 선천면역 세포로서, 환경적 신호에 따라 포식 행동이 달라질 수 있다. 대식세포는 전체 표적 세포를 포식할 수도 있지만, trogocytosis를 통해 세포의 일부만을 획득하기도 한다. 지금까지 대식세포의 포식 행동은 주로 ‘표적 세포의 일부를 획득했는가 여부’라는 이분법적 기준으로 분석되어 왔으며, trogocytosis에 대한 정량적이고 포괄적인 분석은 제한적이었다. 본 연구에서는 유세포분석법을 기반으로 대식세포의 세밀한 포식 행동을 정량적으로 평가할 수 있는 방법을 고안하고, 이를 다양한 생화학적·생물물리적 조건에서 분화된 인간 1차 대식세포에 적용하였다. 먼저, 말초혈 단핵세포로부터 분리한 단핵구를 M-CSF 또는 GM-CSF로 처리하여 대식세포로 분화시킨 뒤, 각각 LPS/IFN-γ 또는 IL-4에 노출하여 M1과 M2로 극화시켰다. 이후 이들 세포의 형태, 표현형, 포식 행동을 분석하였다. 그 결과, 대식세포의 형태와 포식 행동은 M1/M2 극화 상태보다는 M-CSF와 GM-CSF와 같은 분화 인자에 의해 주로 결정되는 것으로 나타났다. M-CSF로 분화된 대식세포는 세포 형태가 길게 늘어나며 활발한 막 trogocytosis를 보인 반면, GM-CSF로 분화된 대식세포는 둥근 형태를 유지하고 전체적인 포식 활성이 현저히 감소하였다. 추가로, 세포를 홈이 새겨진 나노 구조에 배양하여 홈 방향으로 유도된 세포 신장을 확인하고, 형태가 포식 행동 조절의 핵심 요인인지 평가하였다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• Chapter 2. Materials and Methods 6
• 2.1. Preparation of primary immune cells and cancer cell lines 6
• 2.2. Fabrication of nanostructured surfaces 7
• 2.3. Flow cytometry (general acquisition & antibodies) 7
• 2.4. Phagocytosis and trogocytosis assay 8
• 2.5. F-actin staining and fluorescence imaging 9
• 2.6. Scanning electron microscopy 9
• 2.7. Statistical analysis 10
• Chapter 3. Results and Discussion 12
• 3.1. Baseline characterization of human monocyte-derived macrophage 12
• 3.2. Nanogroove-induced elongation of macrophages 17
• 3.3. Functional modulation of macrophages by nanogroove-induced elongation 24
• Chapter 4. Conclusion 26
• Bibliography 28
• Abstract in Korean 32