Metabolic Engineering of Vibrio natriegens for Limonene Biosynthesis by CRISPRi-Mediated Isoprenoid Pathway Optimization = CRISPRi 기반 이소프레노이드 경로 최적화를 통해 개량된 비브리오 나트리에겐스의 리모넨 생합성

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Terpenoids represent one of the most structurally diverse and industrially significant classes of natural products, with established applications in pharmaceuticals, fragrances, specialty chemicals, and renewable fuels. Despite major advances in metabolic engineering, microbial production of monoterpenes such as limonene remains challenging due to limited precursor availability, poor functional expression of plant-derived terpene synthases, and intrinsic product cytotoxicity. The ultrafast-growing, non-pathogenic bacterium Vibrio natriegens has recently emerged as a promising host for high productivity biomanufacturing, yet its potential for terpenoid biosynthesis has not been systematically explored. This study establishes a foundational framework for limonene biosynthesis in V. natriegens by integrating precursor pathway enhancement, heterologous enzyme expression, and CRISPR interference–based translational regulation.

A previously engineered V. natriegens strain harboring a genomically integrated heterologous mevalonate (MVA) pathway served as the base platform. To further enhance precursor availability, the endogenous methylerythritol phosphate (MEP) pathway was reinforced by expressing a polycistronic operon encoding the key bottleneck enzymes DXS, DXR, and IDI. Increases in pathway flux were assessed through quantitative measurement of isopentenol, which served as a metabolic indicator of intracellular IPP/DMAPP availability.

Multiple limonene biosynthetic operons were constructed by combining different geranyl or neryl pyrophosphate synthases with plant-derived limonene synthases. To address the poor solubility of limonene synthase in V. natriegens, N-terminal truncation and SUMO-fusion strategies were applied. Although SUMO fusion significantly improved soluble expression of limonene synthase, limonene production remained at extremely low levels under all tested conditions, indicating that enhanced solubility alone is insufficient to enable efficient monoterpene biosynthesis in this host.

To enable tunable redistribution of isoprenoid precursors, a translation-level CRISPR interference (Tl-CRISPRi) system optimized for V. natriegens was established. The system was systematically characterized using genomically integrated fluorescent reporters, followed by targeted knockdown of the native ispB gene, a major consumer of downstream isoprenoid intermediates. Efficient and inducible repression of ispB was confirmed at the protein level, demonstrating the applicability of Tl-CRISPRi for regulating essential metabolic branch points in terpenoid biosynthesis.

Collectively, this work identifies key metabolic and physiological constraints that limit monoterpene production in V. natriegens and establishes essential genetic and regulatory tools for subsequent pathway optimization. These findings advance V. natriegens as a promising microbial chassis for industrial terpenoid synthesis and lay the groundwork for achieving enhanced limonene production through integrated metabolic rewiring.

국문 초록 (Abstract)

테르페노이드는 의약품, 향료, 기능성 소재 및 바이오연료 등 여러 산업 분야에서 중요한 가치를 지닌 화합물 군으로, 그 구조적 다양성과 응용 가능성에 따라 미생물 기반의 생산 기술 개발이 활발하게 요구되고 있다. 그러나 대사공학 기술의 지속적인 발전에도 불구하고, 리모넨과 같은 단일테르펜(monoterpene)의 미생물 생산은 전구체 공급의 제한, 식물 유래 테르펜 합성효소의 낮은 기능적 발현, 그리고 생성물의 세포 독성으로 인해 효율적인 생산에 제약이 존재한다. 초고속 증식 특성과 비병원성을 지닌 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens)는 고생산성 미생물 공정을 위한 새로운 플랫폼 균주로 주목받고 있으나, 테르페노이드 생합성 관점에서의 활용 가능성은 아직 체계적으로 규명되지 않았다. 본 연구는 전구체 경로 강화, 이종 효소 발현, 그리고 번역 수준의 CRISPR 간섭 조절 기술을 통합함으로써 비브리오 나트리에겐스에서 리모넨 생합성을 구현하기 위한 공학적 기반을 확립하고자 하였다.

기반 균주로는 선행연구에서 이종 메발론산 경로(mevalonate pathway)를 염색체에 도입한 비브리오 나트리에겐스 균주를 활용하였다. 전구체 공급을 추가로 향상시키기 위해, 내재적 메틸에리트리톨 인산 경로(methylerythritol phosphate pathway)의 주요 병목 효소인 DXS, DXR, IDI를 암호화하는 다유전자 오페론을 발현시켜 해당 경로를 강화하였다. 전구체 경로의 대사 흐름 변화는 세포 내 이소펜테닐 피로인산(isopentenyl pyrophosphate, IPP)과 디메틸알릴 피로인산(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)의 가용성을 대변하는 대사 지표로서 이소펜테놀(isopentenol)의 정량 분석을 통해 평가하였다.

리모넨 생합성 구현을 위해 서로 다른 제라닐 또는 네릴 피로인산 합성효소(geranyl or neryl pyrophosphate synthase)와 식물 유래 리모넨 합성효소(limonene synthase)를 조합한 다양한 생합성 오페론을 구축하였다. 또한 비브리오 나트리에겐스에서 리모넨 합성효소의 낮은 용해도를 개선하기 위해 N-말단 절단 및 SUMO 융합 전략을 적용하였다. SUMO 융합을 통해 리모넨 합성효소의 가용성 발현은 유의미하게 증가하였으나, 모든 조건에서 리모넨 생산량은 극히 낮은 수준에 머물렀으며, 이는 효소의 용해도 향상만으로는 해당 균주에서 단일테르펜 생합성의 주요 제한 요인이 해소되지 않음을 시사한다.

이소프레노이드 전구체의 세포 내 분배를 정밀하게 조절하기 위해, 비브리오 나트리에겐스에 최적화된 번역 수준 CRISPR 간섭(translation-level CRISPR interference, Tl-CRISPRi) 시스템을 구축하였다. 해당 시스템은 염색체에 통합된 형광 리포터를 이용해 체계적으로 성능이 검증되었으며, 이후 하위 이소프레노이드 중간체의 주요 소비 효소로 기능하는 내재 유전자 ispB를 표적으로 억제하였다. 그 결과, ispB의 효율적이고 유도 가능한 억제가 단백질 수준에서 확인되었으며, 이를 통해 Tl-CRISPRi가 테르페노이드 생합성에서 핵심적인 대사 분기점 조절에 적용 가능함을 입증하였다.

종합적으로 본 연구는 비브리오 나트리에겐스에서 단일테르펜 생산을 제한하는 주요 대사적·생리적 제약 요인을 규명하고, 향후 경로 최적화를 위한 핵심적인 유전적 및 조절 도구를 확립하였다. 이러한 결과는 비브리오 나트리에겐스를 산업적 테르페노이드 생산을 위한 미생물 생산 플랫폼으로 확장하는 데 기여하며, 리모넨 생산성 향상을 위한 통합적 대사 재설계의 토대를 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• List of Tables vi
• List of Figures viii
• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1. Terpenoid biosynthesis and microbial production 2
• 1.2. Vibrio natriegens as a next-generation host 4
• 1.3. Precursor supply bottlenecks in monoterpene biosynthesis 6
• 1.4. Limitations of terpene synthase solubility and expression 8
• 1.5. Need for dynamic metabolic control tools (CRISPRi) 10
• 1.6. Scope of this thesis 12
• Chapter 2. Materials and Methods 15
• 2.1. Bacterial strains, plasmids, primers and reagents 16
• 2.2. Culture conditions 17
• 2.3. Preparation of competent cells and plasmid transformation 17
• 2.4. Natural transformation and scarless genome editing of Vibrio natriegens 18
• 2.5. Construction of genetic components for limonene biosynthesis and the Tl-CRISPRi system 19
• 2.6. Gene refactoring, UTR design, and promoter strength prediction 20
• 2.7. Fluorescence assay 20
• 2.8. Production and quantification of limonene 21
• 2.9. Isopentenol quantification 21
• 2.10. Western blot analysis 22
• Chapter 3. Results and Discussion 33
• 3.1. Limonene biosynthesis in MVA pathway–integrated Vibrio natriegens 34
• 3.1.1. Selection and truncation of synthase candidates for limonene biosynthesis 38
• 3.1.1.1. Limonene synthase 38
• 3.1.1.2. Geranyl pyrophosphate synthase and neryl pyrophosphate synthase 40
• 3.1.2. Construction of limonene biosynthetic operons 44
• 3.1.3. Limonene production from glycerol as a sole carbon source and its quantification 47
• 3.2. Limonene biosynthesis in MVA-integrated and MEP-enhanced Vibrio natriegens 49
• 3.2.1. Enhancement of the endogenous MEP pathway in Vibrio natriegens 49
• 3.2.1.1. Screening of DXS homologs and operon construction for overexpression of MEP pathway bottlenecks 49
• 3.2.1.2. Functional validation of heterologous MVA pathway and enhanced MEP pathway via isopentenol quantification 52
• 3.2.2. Expression of heterologous limonene synthase and improvement of solubility using SUMO fusion 58
• 3.2.3. Limonene production utilizing optimized isoprenoid precursor pathways under various cultivation conditions 65
• 3.3. Optimization and application of translation-level CRISPR interference (Tl-CRISPRi) system in Vibrio natriegens 69
• 3.3.1. Design and construction of single- and dual-vector CRISPRi architectures 71
• 3.3.2. Evaluation of knockdown efficiency using fluorescent reporter assays 73
• 3.3.3. Optimization of spacer length and inducer concentration for efficient knockdown 77
• 3.3.3.1. Spacer length optimization 77
• 3.3.3.2. Inducer concentration optimization 79
• 3.3.4. Validation of ispB knockdown by Western blot analysis 82
• 3.4. Discussion and future perspectives 87
• Chapter 4. Conclusion 92
• References 96
• Supplementary data 102
• Abstract in Korean 119