Functional Demonstration of IS200/IS605 TnpA Transposase in Human Cells = 인간 세포 내 IS200/IS605 TnpA 전이 효소의 기능성 입증

국문 초록 (Abstract)

전이요소(transposable elements, TEs)는 오랫동안 분자적 혁신의
보고로 작용하며, CRISPR-Cas 뉴클레아제의 진화적 조상과 같은 필수
구성요소를 숙주 유전체에 제공해 왔다. IS200/IS605
상과(superfamily)는 단일가닥 DNA(single-stranded DNA, ssDNA)
중간체를 이용하고 HUH 계열 전이효소 TnpA가 매개하는 독특한
“peel-and-paste” 방식의 전이를 수행한다는 점에서 다른
전이요소와 구별된다. 이 계열의 진화적 친연체인 TnpB와 IscB는 이미
인간 세포에서 Cas12 및 Cas9과 같은 RNA-유도 유전자 편집 도구로
성공적으로 재활용되었으나, 정작 원천 전이효소인 TnpA의 활성은
어떤 진핵 세포에서도 입증된 바 없었다. 본 연구에서는 TnpA가 인간
세포에서도 촉매 활성을 유지함을 처음으로 증명하고, 그 유전체 삽입
양상을 체계적으로 규명하였다.
우선, AlphaFold3 기반 구조 예측과 보존된 촉매 모티프를
우선적으로 고려하는 in silico 파이프라인을 구축하여, Youngiibacter
multivorans 유래 ISYmu1 TnpA를 유망한 후보 전이효소로
선별하였다. 이어서, TnpA의 고유한 ssDNA 의존적 전이 기전을
모사하기 위해 Epstein-Barr virus(EBV) 유래 플라스미드를
자가복제성 도너로 활용하여 인간 세포에서의 활성을 재구성하였다. 그
결과, HEK293T, HeLa, U2OS를 포함한 여러 인간 세포주에서 TnpA가
도너 트랜스유전자를 유전체에 효율적으로 통합할 수 있음을
확인하였으며, 이러한 통합 활성은 TnpA 발현량과 도너의 복제 여부에
의존적임을 입증하였다.
GUIDE-seq에 decoy primer 전략을 결합한 전장 유전체 수준의
삽입 부위 분석을 통해, TnpA가 독특한 “세이프 하버(safe-harbor)
유사” 통합 양식을 보인다는 사실을 발견하였다. 구체적으로, TnpA는
조절적 이질염색질(facultative heterochromatin; gpos25–50) 내
인트론 영역을 선호하면서, 단백질 코딩 엑손 및 고도로 치밀한 구성적
이질염색질 영역은 회피하는 경향을 나타냈다. 이러한 통합 패턴은 활성
프로모터를 선호하는 레트로바이러스 벡터나 비교적 무작위적인 삽입
양상을 보이는 기타 전이 시스템과 달리 삽입 돌연변이 유발 위험을
완화시키는 특징을 갖는다. 더 나아가, dCas9-TnpA 융합 단백질을
제작하여 이 복합체가 이중가닥 절단(double-strand break, DSB)을
유도하지 않은 상태에서도 전이를 촉매할 수 있음을 확인함으로써,
절단이 수반되지 않는(programmable, cleavage-free) 표적 통합의
개념 증명을 제시하였다.
종합하면, 본 연구는 TnpA가 인간 세포에서 기능하는
전이효소임을 입증함과 동시에, 인트론 및 특정 이질염색질을 선호하는
고유한, 안전성 편향(safety-biased)의 통합 문법을 가진다는 것을
보여준다. 이는 TnpA가 정밀 유전체 공학을 위한 새로운 도구로서
잠재력을 지님을 의미하며, 향후 보다 안전한 유전자 통합 전략 개발을
위한 기반을 제공한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Transposable elements (TEs) have long been recognized as
reservoirs of molecular innovation, contributing essential
components to host genomes, including the evolutionary ancestors
of CRISPR-Cas nucleases. Among these, the IS200/IS605
superfamily is distinct for its use of single-stranded DNA (ssDNA)
intermediates and a unique “peel-and-paste” transposition
mechanism catalyzed by the HUH-family transposase TnpA and
RNA-guided endonuclease TnpB. While member of this family—
TnpB (ancestor of Cas12)—have been successfully adapted for
RNA-guided genome editing in human cells, the activity of the
transposase TnpA itself has not yet been demonstrated in
eukaryotic systems. This study provides the first evidence that
TnpA retains catalytic competence in human cells and elucidates its
genomic integration profile.
We identified a candidate transposase, ISYmu1 TnpA from
Youngiibacter multivorans, through an in silico pipeline prioritizing
motif conservation and structural integrity predicted by AlphaFold3.
To reconstitute its activity in human cells, we utilized Epstein-Barr
virus (EBV)-derived plasmids as autonomously replicating donor
templates that mimic the ssDNA intermediates required for native
transposition. We demonstrated that TnpA mediated efficient
genomic integration of donor transgenes in various human cell lines,
including HEK293T, HeLa, and U2OS, in a dose-dependent and
replication-dependent manner.
Genome-wide integration site analysis via GUIDE-seq coupled
with a decoy primer strategy revealed “safe-harbor-like”
integration profile. TnpA exhibited a moderate but statistically
certain preference for intronic regions within facultative
heterochromatin (gpos25–50), while avoiding exonic coding
sequences and dense constitutive heterochromatin. This pattern
minimizes the risk of insertional mutagenesis, distinguishing TnpA
from retroviral vectors that target active promoters or other
transposons with random integration profiles. Furthermore, we
engineered a dCas9-TnpA fusion protein and demonstrated its
ability to mediate transposition without inducing double-strand
breaks (DSBs), offering a proof-of-concept for programmable,
cleavage-free targeted integration. Collectively, these findings
establish TnpA as a functional transposase in human cells with a
unique integration grammar that tends to favor safer genomic
contexts, expanding the toolbox for precise genomic engineering.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT 3
• TABLE OF CONTENTS 6
• LIST OF FIGURES 10
• LIST OF TABLES 11
• LIST OF ABBREVIATIONS 12
• CHAPTER I. Background 14
• CHAPTER II. Results
• INTRODUCTION 18
• MATERIALS AND METHODS
• 1. In Silico Analysis and Candidate Selection 23
• 2. Cloning of TnpA constructs 23
• 3. Mammalian cell culture conditions 24
• 4. Transfection protocols and genomic DNA extraction 24
• 5. Confocal Microscopy 25
• 6. Flow Cytometry Analysis and Quantification of GFP Expression 25
• 7. Generation of Split-GFP Reporter Cell Line via Prime Editing 26
• 8. Statistical Analysis 26
• 9. GUIDE-seq Library Preparation and Decoy Primer Strategy 27
• 10. Annotation of Genomic Integration Sites 28
• RESULTS
• 1. TnpA candidate selection via in silico analysis of motif conservation and structure prediction by AlphaFold3 31
• 2. ISYmu1 TnpA from Youngiibacter multivorans: Structural Validation and Targeting Determinants 34
• 3. TnpA transposase exhibits activity in human cells when provided with replication‑competent plasmid EBV‑derived donors. 40
• 4. Replication competency and end structure integrity are essential for TnpA activity 48
• 5. Validation of TnpA Versatility in Different Human Cell Lines and Fusion with Other Protein 49
• 6. TnpA-Mediated Integration of ssDNA Donors is Limited by Substrate Stability and Structural Requirements 50
• 7. Establishment of dCas9-TnpA Fusion and a Quantitative Split-GFP Reporter System 56
• 8. Limited Efficiency of Targeted Integration Using a Programmable Cas9 TnpA Transposase 56
• 9. Guide-seq joined with decoy primer strategy to seek TnpA's genomic integration pattern 61
• 10. Genome-wide Integration Profiling Reveals TnpA Preference for Intronic and Facultative Heterochromatin Regions 67
• DISCUSSION 76
• REFERENCES 82
• ABSTRACT IN KOREAN 87
• APPENDIX 89