인간 유도만능줄기세포 유래 심장 오가노이드를 이용한 심독성 평가와 분화 효율 향상 연구 = Cardiotoxicity Assessment Using Human iPSC-Derived Cardiac Organoids and Strategies to Improve Differentiation Efficiency

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cardiotoxicity and insufficient therapeutic efficacy remain major causes of drug attrition during clinical development, underscoring the need for preclinical models that more accurately recapitulate human cardiac physiology. Conventional two-dimensional cardiomyocyte cultures lack three-dimensional cell–cell and cell–matrix interactions, whereas animal models are limited by species-specific differences and ethical constraints. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac organoids have emerged as a promising alternative; however, heterogeneity and incomplete maturation continue to hinder their predictive reliability.
In this study, we established a robust differentiation platform to generate structurally and functionally mature hiPSC-derived cardiac organoids (hCOs). Uniform embryoid bodies were produced using a controlled 3D culture system, followed by stage specific Wnt modulation. The resulting hCOs displayed spontaneous beating for over three weeks, with cell type compositions resembling adult myocardium including cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. Molecular profiling and immunofluorescence analyses confirmed strong expression of cardiac markers (cTnT, α-actinin), fibroblast and endothelial markers, and key cardiac ion channels (Cav1.2, Nav1.5, hERG).
Electrophysiological characterization using a multi-electrode array (Multi-electrode array, MEA) demonstrated stable field potential amplitude, Fridericia-corrected field potential duration (FPDcF), and beat regularity. Furthermore, hCOs exhibited physiologically relevant responses to channel-specific blockers: nifedipine (Ca2+), E-4031 (hERG), and flecainide (Na+), validating their suitability for proarrhythmia assessment.
To evaluate clinical drug safety, we tested Echinochrome A (EchA), a marine-derived compound used clinically. EchA (up to 30 µM) did not alter BPM, FPA, and FPDcF and did not induce QT prolongation or early afterdepolarizations. Cell viability assays, LDH release tests, and contraction analyses confirmed the absence of cytotoxicity or functional impairment. In contrast, known cardiotoxic agents including doxorubicin, sorafenib, and 5-fluorouracil produced dose-dependent reductions in viability, demonstrating the model’s sensitivity in detecting cardiotoxic responses.
To improve differentiation efficiency and reduce organoid heterogeneity, we further applied ZM447439 (ZM), an Aurora kinase A/B inhibitor, during defined stages of mesodermal specification. ZM treatment induced G1-phase enrichment and enhanced lineage allocation toward cardiomyocytes, fibroblasts, and endothelial cells. RNA sequencing revealed upregulation of genes associated with sarcomere assembly, Z-disc and I-band structure, ion channel activity, and myocardial contractility. Consistent with these transcriptional changes, ZM-treated hCOs exhibited heightened electrophysiological maturity and more pronounced pharmacological responses in MEA assays.
Collectively, this study demonstrates that hiPSC-hCOs provide a reliable and physiologically relevant platform for cardiotoxicity assessment, drug safety evaluation, and mechanistic studies of cardiac function. Furthermore, cell-cycle modulation via Aurora kinase inhibition represents an effective strategy to enhance the structural and electrophysiological maturation of cardiac organoids, thereby improving their reproducibility and translational value. These findings contribute to the development of next generation preclinical cardiac models capable of more accurately predicting human cardiac responses.

국문 초록 (Abstract)

신약 개발 과정에서 후보 물질의 탈락은 주로 심장 독성과 낮은 유효성에 기인하며, 이는 비임상 단계에서 인간 생리와 충분히 유사한 평가 모델의 필요성을 강조한다. 기존의 2차원 배양 심근세포 모델은 세포와 세포 간, 세포와 세포 외 기질 간 상호작용이 제한되어 있고, 동물 모델은 종간 차이 및 윤리적 문제로 인해 인간 심장 반응의 정확한 예측에 한계를 가진다. 이러한 문제를 해결하기 위한 대안으로 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs) 기반의 심장 오가노이드(cardiac organoids)가 주목받고 있으나, 분화 조건과 세포주 변화에 따른 구조 및 기능적 이질성(heterogeneity)과 성숙도 부족이 여전히 개선 과제로 남아 있다.
본 연구에서는 유도만능줄기세포로부터 균일한 크기의 3차 구조체를 형성하고, Wnt 신호 조절 기반의 단계적 분화 프로토콜을 적용하여 3차원 구조, 자발적 박동, 다세포 구성 등을 갖춘 성숙도 높은 심장 오가노이드(hCO)를 제작하였다. 제작된 심장 오가노이드는 3주 이상 안정된 자발 박동적 박동(평균 30–90 BPM)을 유지하며, 분자 수준에서 심근세포(cTnT), 심장 섬유아세포(Vimentin), 내피세포(VE-cadherin)의 발현이 인간 심장 조직과 유사하게 나타났다. 이와 함께 Cav1.2, Nav1.5, hERG 등 주요 심장 이온 채널의 발현이 유의하게 증가하였고, 면역형광분석 및 FACS 분석에서도 성인 심장에 가까운 세포 구성 비율이 확인되었다.
전기생리학적 특성 분석을 위해 다중전극어레이(Multi-electrode array, MEA)를 적용한 결과, 제작된 심장 오가노이드는 정상 범위의 field potential amplitude(FPA), Fridericia 보정 field potential duration (FPDcF) 및 박동 간격 안정성을 나타냈다. 또한 이온 채널 특이적 억제제 처리 실험에서 Ca²⁺ 차단제(nifedipine), hERG 억제제(E-4031), Na⁺ 차단제(flecainide)에 대해 기존 심장 모델과 일관된 반응을 보이며 주요 심장 이온 채널 기능성이 정상적으로 유지됨을 확인하였다.
임상적으로 사용 중인 해양 유래 천연물질 Echinochrome A (EchA)의 심장 안전성을 평가한 결과, 최대 30 µM 농도에서도 BPM, FPA, FPDcF에 변화가 없었으며 QT 연장, 조기 탈분극(EAD) 등 부정맥 징후도 관찰되지 않았다. 세포 생존도(ATP assay)와 LDH 누출 분석, 이미지 기반 수축력 분석에서도 독성이 나타나지 않아 EchA의 심장 전기생리적 및 구조적 안전성을 확인하였다. 반면, 심독성이 알려진 doxorubicin, sorafenib, 5-FU 등 항암제를 처리했을 때 농도 의존적 생존율 감소가 나타나 심장 오가노이드 모델이 임상 독성 예측에 유효함이 증명되었다.
또한 본 연구는 심장 오가노이드의 이질성을 줄이고 분화 효율 및 기능적 성숙도를 개선하기 위한 새로운 접근으로 Aurora kinase 억제제인 ZM447439(ZM)를 분화 과정 특정 단계에서 처리하였다. ZM 처리는 세포주기 G1기 정체를 유도하여 중배엽 분화 과정의 세포 계통 구성을 변화시켰으며, 그 결과 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피세포 관련 마커 발현이 증가하였다. RNA-seq 분석에서는 sarcomere, Z-disc, I-band 구성 유전자 발현 증가, 심수축 기능 관련 유전자 활성화, 전기생리 관련 이온 채널 유전자(Cav1.2, Nav1.5, hERG) 발현 증가가 확인되어 심근세포 기능 및 구조 성숙도가 향상됨을 뒷받침하였다. MEA 실험에서도 ZM 처리군에서 주요 이온 채널 억제제 반응성이 더욱 뚜렷하여 기능적 성숙도가 강화되었음을 확인하였다.
종합적으로, 본 연구는 인간 유도만능줄기세포 기반 심장 오가노이드가 정확한 심독성 예측과 약물 안전성 평가에 적합한 모델임을 입증하였으며, 세포주기 조절 기반의 Aurora kinase 억제 전략이 구조적 및 전기생리학적 성숙도를 강화하여 심장 오가노이드의 분화 효율과 재현성(robustness)을 향상시키는 새로운 접근임을 제시한다. 본 연구는 향후 비임상 단계에서 인간 반응성을 보다 정밀하게 모사하는 차세대 심장 모델 개발에 중요한 기여를 할 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 i
• 전체 서론 1
• 제 1 부 인간 유도만능줄기세포 유래 심장 오가노이드를 활용한 심장 독성 평가 4
• 제 1 장 서 론 5
• 1.1 비임상 심장 모델의 필요성 5
• 1.2 심장 독성 유발 물질 6
• 1.3 Echinochrome A 9
• 제 2 장 재료 및 방법 11
• 제 3 장 결 과 21
• 3.1 인간 유도만능줄기세포 품질 관리 21
• 3.2 인간 유도만능줄기세포 주 유래 심장 오가노이드 제작 24
• 3.3 제작된 심장 오가노이드의 분자적 특성 27
• 3.4 제작된 심장 오가노이드 전기생리적 특성 31
• 3.5 이온 채널 억제제를 이용한 심부정맥 평가 34
• 3.6 EchA에 대한 심부정맥 평가 36
• 3.7 심장 오가노이드에서 심독성 약물을 이용한 심장 세포 독성 확인 38
• 3.8 EchA가 심장 오가노이드의 세포 독성에 미치는 영향 40
• 3.9 EchA가 심장 오가노이드의 세포 수축력에 미치는 영향 42
• 제 4 장 결론 및 고찰 44
• 4.1 심장 오가노이드 구성 세포 44
• 4.2 심장 오가노이드의 약물 반응성 46
• 4.3 기존 심장 오가노이드 한계점 50
• 4.4 결론 50
• 제 2 부 오로라 키나아제 억제제를 이용한 인간 유도만능줄기세포 유래 심장 오가노이드 생성 및 성숙도 개선 52
• 제 1 장 서 론 53
• 1.1 인간 유도만능줄기세포 유래 심장모델 53
• 1.2 Wnt 신호 전달 경로와 심장 발달 55
• 1.3 오로라 키나아제의 세포 내 역할 56
• 제 2 장 재료 및 방법 59
• 제 3 장 결 과 64
• 3.1 ZM 처리에 의한 심근세포 분화 64
• 3.2 ZM을 사용해 분화한 심장 오가노이드의 심장 연관 유전자 발현 향상 70
• 3.3 ZM을 처리해 분화한 심근세포의 이온 채널 발현 향상 74
• 제 4 장 토의 및 결론 82
• 4.1 분화 과정에서 오로라 키나아제의 역할 83
• 4.2 심장 오가노이드의 전기생리적 반응 86
• 4.3 한계점 86
• 4.4 결론 88
• 참고문헌 89
• Abstract 112