식이 비타민 D 보충이 제2형 당뇨병 마우스의 골격근 포도당 대사 및 근위축에 미치는 영향 = Effects of dietary vitamin D supplementation on skeletal muscle glucose metabolism and muscle atrophy in type 2 diabetic mice

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Skeletal muscle is a primary organ responsible for the majority of insulin-induced glucose metabolism and plays a critical role in systemic glycemic regulation. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) leads to various complications due to chronic hyperglycemia and insulin resistance, with diabetic muscle atrophy being a representative consequence. Muscle atrophy is triggered by various pathological factors and is characterized by accelerated muscle protein degradation and a reduction in skeletal muscle mass. Meanwhile, vitamin D acts as a factor that maintains energy metabolic homeostasis in skeletal muscle and promotes muscle protein synthesis. Although numerous studies have reported that vitamin D supplementation improves insulin sensitivity and glucose metabolism efficiency in T2DM, conflicting results remain regarding its actual effects on increasing skeletal muscle mass and its underlying molecular mechanisms. In particular, since diabetic muscle atrophy is a complication that develops over a long period, there is a lack of understanding regarding the protective effects of vitamin D supplementation according to the progression stages of diabetes. Therefore, this study aimed to investigate the efficacy of vitamin D according to the progression of diabetes by supplementing vitamin D from the early stages of life and to precisely analyze its time-dependent effects by dividing the intervention into several periods. Male offspring obtained by mating female and male BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/+/J mice were used. Male Lepr+/+ (Wild-type, WT) and Leprdb/db (Diabetic, DB) mice were provided with either a control diet (fat 10 kcal%, 1,008 IU vitamin D3/kg diet; vDC) or a vitamin D-supplemented diet (fat 10 kcal%, 9,538 IU vitamin D3/kg diet; vDS) for 3, 6, or 9 weeks starting from the time of weaning. Following the dietary intervention, body weight and fasting blood glucose were measured. Serum, visceral fat, subcutaneous fat, gastrocnemius, soleus, quadriceps femoris, and tibialis anterior muscles were collected. Serum 25(OH)D concentrations were measured, and RT-qPCR was performed to assess expression of genes related to muscle atrophy, glucose metabolism, inflammation, and endoplasmic reticulum (ER) stress. Skeletal muscle mass and muscle fiber cross-sectional area (CSA) were determined to evaluate muscle atrophy. At the 6-week time point, the DB-vDS group exhibited lower fasting plasma glucose level and visceral fat weight compared to the DB-vDC group. At the 6-week and 9-week intervention points, the DB-vDC group had higher dietary and energy intake compared to the WT-vDC and WT-vDS groups, whereas the DB-vDS group showed no significant difference from the WT groups. At all intervention points, the skeletal muscle mass of the DB groups was lower than that of the WT groups. While there were no differences in muscle fiber CSA between groups at the 3-week point, the WT-vDS group showed the highest CSA at the 6-week point, and the WT groups were higher than the DB groups at the 9-week point. The expression of Fbxo32 showed no significant differences at the 3-week and 9-week points; however, it was significantly higher in the WT-vDS group compared to all other experimental groups at the 6-week point. Although there was no significant difference in the expression of Slc2a4 between groups, Hk2 expression was higher in the DB-vDS group than in the DB-vDC group at the 6-week point, whereas it was lower in the DB-vDS group compared to the DB-vDC group at the 9-week point. In conclusion, these findings suggest that the effects of vitamin D supplementation vary depending on the duration of the intervention. 3 weeks of supplementation exerted no significant metabolic changes across all groups regardless of diabetic status, whereas 6 weeks of vitamin D supplementation promoted anabolic muscle growth under normal physiological conditions and induced the recovery of systemic metabolic homeostasis in a diabetic pathophysiological environment. 9-week supplementation appeared to trigger intrinsic protective mechanisms to preserve energy homeostasis in the skeletal muscle of the diabetic group.

국문 초록 (Abstract)

제2형 당뇨병에서는 만성적인 고혈당과 인슐린 저항성으로 인해 다양한 합병증이 발생하게 되는데, 그 중 대표적인 것이 당뇨성 근위축이다. 근위축은 여러 가지 병리적 요인에 의해 발생하며 근단백질 분해 가속화와 골격근량 감소가 대표적인 특징이다. 한편, 비타민 D는 골격근의 에너지 대사 항상성을 유지하고 근단백질의 합성을 촉진하는 인자로 작용한다고 보고되었다. 또한 제2형 당뇨병에서 비타민 D 보충 시 인슐린 민감도가 개선되고 포도당 대사의 효율을 향상시킨다는 다수의 보고가 있으나, 실제 골격근량 증진 효과 및 분자적 기전에 대해서는 여전히 상충된 연구 결과가 존재한다. 특히 당뇨성 근위축은 장기간에 걸쳐 일어나는 합병증으로, 당뇨의 진행 단계에 따른 비타민 D 보충의 보호 효과에 대한 이해는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 생애 초기 단계부터 비타민 D를 보충하여 당뇨의 진행 과정에 따른 비타민 D의 효과를 확인하고자 하였으며, 여러 중재 기간으로 나누어 시기별 영향을 분석하고자 하였다. 암컷과 수컷 BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/+/J 마우스를 교배하여 얻은 산자 중 수컷 Lepr+/+ (Wild-type, WT)와 Leprdb/db (Diabetic, DB) 마우스에게 이유 시점부터 대조 식이(지방 10 kcal%, 1,008 IU 비타민 D3/kg diet; vDC) 또는 비타민 D 보충 식이(지방 10 kcal%, 9,538 IU 비타민 D3/kg diet; vDS)를 3주, 6주, 또는 9주 동안 제공하였다. 식이 중재 이후 실험 동물의 체중과 공복 혈당을 측정하였으며, 희생 후 혈액, 내장 지방, 피하 지방, 비복근(gastrocnemius), 가자미근(soleus), 대퇴사두근(quadriceps femoris), 전경골근(tibialis anterior muscle)를 채취하였다. 혈청에서 25(OH)D 농도를 측정하였으며 조직형태학적 분석 및 조직 내 특정 유전자들의 발현 분석을 위해 H&E 염색 및 RT-qPCR을 수행하였다. 골격근의 근위축 정도를 평가하기 위해 양쪽 다리의 골격근 질량과 근섬유 단면적을 측정하였으며, 근위축 인자인 F-box protein 32 (Fbxo32)의 mRNA 발현 정도를 분석하였다. 포도당 대사와 관련하여 solute carrier family 2 member 4 (Slc2a4)와 hexokinase2 (Hk2)의 발현 정도를 측정하였으며, 염증 및 소포체 스트레스와 관련하여 suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3), DNA-damage inducible transcript 3 (Ddit3), sliced X-box binding protein 1 (Xbp1s) 및 heat shock protein 5 (Hspa5)의 발현량을 측정하였다. 6주 시점에서 DB-vDS 군은 DB-vDC 군에 비해 공복 혈당과 내장 지방 무게가 낮았다. 6주와 9주 중재 시점에서 DB-vDC 군은 WT-vDC 군 및 WT-vDS 군에 비해 식이 및 에너지 섭취량이 높았으나, DB-vDS 군은 WT 군과 차이가 없었다. 모든 중재 시점에서 DB 군의 골격근 상대 질량은 WT 군에 비해 낮았다. 한편, 6주 중재 시점에서 WT-vDS 군은 WT-vDC 군에 비해 골격근 상대 질량이 유의하게 높았으나, 9주 중재 시점에서는 낮았다. 근섬유 단면적은 3주 중재 시점에서 군 간 차이가 없었지만, 6주 중재 시점에서는 WT-vDS 군이 가장 높았으며, 9주 중재 시점에서는 WT 군이 DB 군보다 높았다. Fbxo32의 발현량은 3주와 9주 중재 시점에서 군 간 유의한 차이가 없었으나, 6주 중재 시점에서는 WT-vDS 군이 다른 모든 실험군에 비해 유의하게 높은 수준을 보였다. Slc2a4의 발현 정도는 군 간 유의한 차이가 없었으나, Hk2의 발현 정도는 6주 중재 시점에서는 DB-vDS 군이 DB-vDC 군보다 발현량이 높은 반면, 9주 중재 시점에서는 반대로 DB-vDS 군이 DB-vDC 군보다 낮은 발현량을 보였다. 결론적으로, 본 연구에서는 3주간의 비타민 D 보충이 당뇨 여부와 무관하게 유의미한 골격근의 대사적 변화를 유도하지 않았으나, 6주간의 식이 비타민 D 보충은 정상 생리 상태에서 근육의 동화적 성장을 촉진하고 당뇨 병태생리 환경에서는 전신 대사 항상성 회복을 유도할 수 있음을 시사한다. 또한, 9주간의 중재는 당뇨군의 골격근 내 에너지 항상성을 유지하기 위한 내인적 방어 기전을 활성화하는 것으로 나타났다.

목차 (Table of Contents)

• 국 문 초 록 ⅰ
• 목 차 iv
• 표 목 차 vi
• 그 림 목 차 vii
• 약 어 목 록 viii
• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 문 헌 고 찰 3
• 1. 제2형 당뇨병과 비타민 D 3
• 2. 제2형 당뇨병에서 골격근의 병리적 변화 6
• 3. 골격근의 대사와 비타민 D 8
• Ⅲ. 연 구 방 법 10
• 1. 실험 동물 및 식이 10
• 2. 유전자형 분석 (Genomic PCR) 14
• 3. 희생 및 시료 수집 17
• 4. 혈청 25(OH)D 농도 분석 18
• 5. 골격근 조직의 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색 및 골격근 섬유 단면적 측정 19
• 6. 조직 RNA 추출, cDNA 합성 및 RT-qPCR 분석 20
• 7. 통계 분석 23
• Ⅳ. 실 험 결 과 24
• 1. 실험동물의 체중, 공복 혈당, 백색 지방량 및 식이 섭취량 24
• 2. 혈청 25(OH)D 농도 29
• 3. 골격근 질량 및 근섬유 단면적 (CSA) 31
• 4. 골격근 조직 내 근위축 관련 유전자 발현 분석 36
• 5. 골격근 조직 내 포도당 대사 관련 유전자 발현 분석 38
• 6. 골격근 조직 내 염증 및 소포체 스트레스 관련 유전자 발현 분석 40
• Ⅴ. 고 찰 42
• Ⅵ. 요 약 49
• 참고문헌 52
• Abstract 57