Structural, Immunological and Epidemiological Investigations for the Development of Vaccine against Bordetella bronchiseptica = Bordetella bronchiseptica 백신 개발을 위한 구조, 면역학적 및 역학적 특성 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Bordetella bronchiseptica is a primary pathogen responsible for canine infectious respiratory disease (CIRD), commonly known as kennel cough. It can induce disease either as a single pathogen or through co-infection with viral and bacterial agents, which contributes to the persistence and complexity of CIRD despite ongoing preventive efforts. With growing emphasis on animal welfare, there is an increasing demand for safer and more effective vaccines. However, current whole-cell and acellular vaccines have limitations in safety and efficacy. In particular, concerns regarding vaccine associated adverse reactions and insufficient protective immunity have highlighted the need to re-evaluate existing vaccination strategies. This study aimed to develop an improved subunit vaccine by integrating structural, immunological, and epidemiological analysis of B. bronchiseptica.
In the first phase, outer membrane proteins (OMPs) and dermonecrotic toxin (DNT) were selected as antigen candidates from a canine isolate. In-silico analysis identified eight domains within DNT, with domains 3 and 5 showing the highest antigenic potential. Based on predicted antigenicity and recombinant protein productivity, DNT domain 3 (DNT-3) was selected as the final antigen candidate. Analysis of OMPs by SDS-PAGE and Western blotting revealed highly antigenic proteins at approximately 20 and 40 kDa. Stimulation of DH82 cells demonstrated that OMPs primarily induced Th1-type cytokines, whereas DNT-3 promoted Th2- and Th17- associated responses. Their combination led to a synergistic increase in IL-23, suggesting that the concurrent use of these antigens may require further evaluation for potential adverse immune effects.
The second phase involved evaluating the safety and immunogenicity of the antigen candidates in murine models. Vaccination with OMPs, alone or with DNT-3, induced strong immune responses and greater than 90 % survival following challenge at doses of 25 µg or higher of OMPs, accompanied by elevated IgG and hemagglutination inhibition (HI) titers. IgG and HI titers increased in a dose-dependent manner following vaccination with OMPs and DNT-3. OMPs alone demonstrated the most favorable safety profile, causing minimal physiological changes post-vaccination. In contrast, mice vaccinated with DNT-3 alone showed limited protective efficacy. Commercial whole-cell vaccines triggered more adverse effects due to cellular wall and toxin components, whereas acellular vaccines exhibited limited protective efficacy.
In the third phase, a systematic review and meta-analysis were conducted to investigate the epidemiological characteristics of B. bronchiseptica co-infections. Among 3,994 screened studies, 26 studies met the predefined inclusion criteria and were included in the final analysis following duplicate removal and stepwise screening. Studies were selected based on laboratory-confirmed B. bronchiseptica infection, explicit reporting of co-infecting respiratory pathogens, and availability of extractable epidemiological data, while non-canine studies, reviews, experimental-only reports, and studies lacking co-infection information were excluded. The pooled prevalence of co-infection was 47 % (95 % CI: 35-57 %), with Mycoplasma spp., and canine respiratory coronavirus (CRCoV) being the most frequent co-pathogens. Studies published in the 1900s reported a significantly higher co-infection rates (77 %) than those published in the 2000s (45 %, p < 0.05), indicating an overall declining trend over time. This decrease is attributable to improvements vaccination coverage, infection control systems, and environmental hygiene. No significant differences were found across geographic regions, housing conditions, or age groups, suggesting that broadly applicable multivalent vaccination strategies may be an effective preventive approach across diverse canine populations.
Collectively, this dissertation presents a comprehensive investigation of B. bronchiseptica antigens and co-infection dynamics. Through integrated structural, immunological, and epidemiological analysis, this study provides foundational data for the development of preventive strategies against canine B. bronchiseptica infection. The immunogenicity and safety of OMPs highlight their use as core components in subunit vaccines. In the context of increasing emphasis on animal welfare, the establishment of preventive strategies that ensure both efficacy and safety is essential. Furthermore, the findings support the necessity of a One Health-based approach, integrating pathogen genetics, immunological characteristics, and epidemiological evidence, for the rational design of vaccines and comprehensive prevention programs targeting canine infectious respiratory diseases.

국문 초록 (Abstract)

Bordetella bronchiseptica는 단독 또는 바이러스 등 다른 병원체들과 복합감염으로 개의 전염성 호흡기 질환(Canine Infectious Respiratory Disease, CIRD)을 유발하는 병원체이다. 이 질병의 예방을 위해 많은 노력을 하였음에도 불구하고 현재까지도 해결하여야 할 많은 문제점을 가지고 있다. 현재 사용중인 전세포백신 (whole cell vaccine)과 무세포백신 (acellular vaccine)은 백신의 안전성, 접종반응, 접종효과 등에서 한계점을 나타내고 있다. 특히 최근 반려동물에 대한 복지 수준이 향상됨에 따라 이러한 부분이 더욱 강조되고 있다. 이에 따라 현재 사용중인 B. bronchiseptica 백신에 대한 새로운 개념의 검토 필요성이 제기되어 왔다. 본 연구에서는 B. bronchiseptica 주요 항원에 대한 구조 및 면역학적 평가와 기존 연구결과의 체계적인 분석을 통하여 B. bronchiseptica 감염예방을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.
이를 위한 첫 단계로 개 유래 B. bronchiseptica 균주의 피부 괴사 독소 (dermonecrotic toxin, DNT) 및 외막 단백질 (outer membrane proteins, OMPs) 분석을 통해 항원 후보군을 발굴하고 그 구조적 특성을 분석하였다. DNT에 대한 in-silico 분석을 통해 항원성을 예측 및 재조합 단백질 생산성 등을 바탕으로 DNT-3를 최종항원으로 선정하였다. OMPs는 SDS-PAGE와 Western blot을 통해 분석한 결과 20 및 40 kDa의 단백질이 높은 항원성을 가진 것을 확인하였다. 개의 면역세포인 DH82 cells에서 DNT-3와 OMP의 사이토카인을 생성을 분석한 결과, OMP는 Th1 관련 사이토카인을, DNT-3는 Th2 및 Th17 관련 사이토카인을 유도하였다. 특히 OMP와 DNT-3 병용하였을 때 IL-23의 상승이 관찰되어, 두 항원을 동시에 사용시 부작용 가능성에 대한 추가적인 검증이 필요함을 시사하였다.
두 번째는 mouse model에서 각 항원의 면역반응 유도능과 예방 효과를 기존 백신들과 비교 평가하였다. OMP 단독 또는 DNT-3와 병용하여 백신을 접종한 후, 체온, 체중, 활력도 등의 생리 지표를 분석한 결과, OMP 단독 백신이 가장 낮은 부작용을 나타내었다. 반면, 현재 사용중인 전세포 백신은 다른 시험군에 비해 부작용의 빈도가 높았으며, 무세포 백신은 면역 유도가 제한적이었다. ELISA 로 측정한 IgG 생성은 OMP 와 DNT-3의 접종량 비례적(dose-dependent)이었다. 혈구응집역가 역시 같은 경향을 나타내었다. 공격접종에서는 OMP 25 μg 이상을 접종한군에서에서 90% 이상의 높은 생존율을 나타냈었다. 반면 DNT-3 만 접종한 실험군에서는 낮은 방어능을 나타내었다.
세 번째 단계로 기존의 연구결과의 메타분석을 통해 B. bronchiseptica의 공동감염 양상에 대한 역학적분석을 수행하였다. 총 3,994편의 문헌을 검토한 후 선정 기준에 부합하는 26편의 연구결과를 최종 분석한 결과, B. bronchiseptica의 공동 감염률은 평균 47 % (95 % 신뢰구간: 35-57 %)였으며, 주요 공동감염 병원체로는 Mycoplasma spp. 및 Canine respiratory coronavirus (CRCoV)가 가장 많았다. 시기별 분석에서는 1900년대 연구에서 공동 감염률이 77 %로, 2000년대 연구의 45 %보다 유의하게 높게 나타났다 (p<0.05). 전반적으로 1900년대 대비 2000년대에 감염률이 낮아지는 경향이 관찰되었다. 진단기술의 발전에도 불구하고 공동 감염률이 낮아진 점은 백신 보급 확대, 감염 관리 체계 개선, 환경 위생 수준 향상 등 전반적인 방역 역량의 향상이 실제 질병 발생률 억제에 기여했기 때문으로 생각된다. 한편, 지역, 사육 형태, 환자의 연령에 따른 차이가 유의하지 않았다는 점은 다양한 개체군에 적용 가능한 복합 백신 개발이 효과적인 예방 전략이 될 수 있음을 시사한다.
종합적으로 본 연구는 B. bronchiseptica의 DNT, OMP 등 주요 항원에 구조적 정보, 백신 후보의 면역학적 유효성과 안전성, 그리고 공동감염 양상에 대한 역학적 분석을 통해 개에서 B. bronchiseptica 감염증에 대해 통합적인 분석을 실시하였다. 이러한 연구결과는 향후 B. bronchiseptica 감염에 의한 개의 전염성호흡기 질병예방을 위한 백신 개발 등 예방기법의 개발에 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각한다. 무엇보다도 동물복지의 중요성이 증가되고 있는 시점에서 개의 전염성 호흡기질병을 포함한 다양한 전염병예방을 위해서는 최신 과학적 기법을 활용한 병원체의 유전, 면역학적 특성 분석을 통해 유효성과 안전성을 확보하고, 동물복지에 부합되는 복합적인 예방대책의 수립이 필요하며, 이는 One Health 적인 접근이 필수적이라고 생각한다.

목차 (Table of Contents)

• General Introduction 1
• Chapter 1. Literature Review 5
• 1. Bordetlla bronchiseptica 6
• 1.1 The genus Bordetella 6
• 1.2 Canine infectious respiratory disease (CIRD) 10
• 1.3 Bordetellosis in other animals 12
• 1.4 Bordetellosis in humans 18
• 2. Virulence factors 21
• 2.1 Dermonecrotic toxin (DNT) 24
• 2.2 Outer membrane proteins (OMPs) 25
• 2.3 Intracellular survival and immune evasion 28
• 3. Immune responses and disease control 31
• 3.1 Immune responses against Bordetella spp 31
• 3.2 Vaccines and disease managements in dogs 34
• 3.3 Vaccines and disease managements in other animals 39
• 3.4 Vaccines and disease managements in humans 43
• Chapter 2. Comparative Structural and Immunological Analysis of Outer Membrane Proteins and Dermonecrotic Toxin in a Canine Isoloate of Bordetella bronchiseptica 49
• Abstract 50
• 1. Introduction 51
• 2. Materials and Methods 54
• 2.1 Bacterial strain 54
• 2.2 In-silico characterizaion of dermonecrotic toxin 55
• 2.3 Synthesis of recombinant DNT -3 and -5 domain proteins 56
• 2.4 Extraction of OMPs 57
• 2.5 SDS-PAGE and Western blot 58
• 2.6 Measurement of cytokine gene expression and production in DH82 cells 59
• 2.7 Challenge test 61
• 2.8 Statistical analysis 62
• 3. Resulsts 62
• 3.1 Structural and functional analysis of DNT 62
• 3.2 Cloning, expression, and purification of DNT-3 and DNT-5 recombinant proteins 63
• 3.3 Extraction and immunological analysis of OMPs 64
• 3.4 Expression and production of the inflammatory cytokines in DH82 cells 65
• 3.5 Mouse survival rates 67
• 4. Discussion 68
• Chapter 3. Safety and Efficacy of an OMP Subunit Vaccine against Bordetella bronchiseptica in a Murine Model 81
• Abstract 82
• 1. Introduction 83
• 2. Materials and Methods 86
• 2.1 Ethics and animals 86
• 2.2 Vaccine preparation and mouse vaccination 87
• 2.3 Body weight, body temperature and vitality 88
• 2.4 Immunoglogulin G (IgG) ELISA for subunit vaccine antigen evaluation 89
• 2.5 Hemagglutination-inhibition (HI) assay 90
• 2.6 Challenge test 91
• 2.7 Statistical analysis 91
• 3. Results 91
• 3.1 Dynamics of physiological parameters for assessing side effects 91
• 3.2 Assessment of immunoglobulin G response according to different vaccine antigens 93
• 3.3 Evaluation of the optical concentration for subunit vaccine candidate antigens 94
• 4. Discussion 96
• Chapter 4. Co-infection with Bordetella bronchiseptica in Canine : A systematic review and meta-analysis 108
• Abstract 109
• 1. Introduction 110
• 2. Materials and Methods 113
• 2.1 Literature searches 113
• 2.2 Study selection criteria 114
• 2.3 Data extraction 115
• 2.4 Quality assessment 115
• 2.5 Statistical analysis 116
• 3. Results 117
• 3.1 Literature search and eligible studies 117
• 3.2 Prevalence and impacts of co-infected pathogens in bordetellosis 118
• 3.3 Co-infection prevalence based on study-related factors 119
• 3.4 Co-infection prevalence based on patients-related factors 120
• 4. Discussion 120
• General Discussion 132
• General Conclusion 137
• References 140
• 국문초록 152