Streptococcus salivarius G7의 항우식 효과에 관한 연구 = Evaluation of the Anti-cariogenic Effects of Streptococcus salivarius G7

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

1. Purpose
This study aimed to investigate the anti-cariogenic effects of Streptococcus salivarius G7 as an oral probiotic. To this end, the antibacterial and antibiofilm activities of S. salivarius G7 against Streptococcus mutans were evaluated in in vitro experiments, and the underlying mechanisms were explored. Based on these findings, an in vivo clinical trial was conducted to assess changes in the oral microbial composition and the suppression of cariogenic bacteria in children.

2. Methods
In in vitro experiments, the spent culture medium of S. salivarius G7 was used to evaluate its antibacterial activity against S. mutans and its inhibitory effects on biofilm formation. The expression levels of S. mutans glucosyltransferase genes (gtfB, gtfC, and gtfD) were quantified using real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR). In addition, a saliva-derived biofilm model was established to observe changes in microbial composition.
Subsequently, a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial was conducted involving 60 children aged 3–12 years who visited a pediatric dental clinic in Gangnam, Korea. The test group received tablets containing S. salivarius G7 for 12 weeks, while the placebo group received tablets without active ingredients under identical conditions. Dental plaque samples were collected at four time points before and during the intervention, and S. mutans and S. salivarius were quantified using real-time PCR (qPCR). Changes in the oral microbiome composition were further evaluated using shotgun metagenomic sequencing.

3. Results
The SCM of S. salivarius G7 inhibited the growth of S. mutans in a concentration-dependent manner, and significantly reduced biofilm thickness and biomass(p < 0.05). The expression levels of gtfB, gtfC, and gtfD were reduced to approximately 65–80% of control levels. In the saliva-derived biofilm model, S. mutans levels markedly decreased, while the proportion of S. salivarius significantly increased, suggesting selective suppression of cariogenic bacteria.
In the clinical trial, the proportion of S. mutans in dental plaque significantly decreased in the test group during the intervention period, whereas the proportion of S. salivarius significantly increased. No significant changes were observed in the placebo group. The Decayed, Missing, and Filled Teeth (DMFT) scores remained stable in the test group but showed an increasing tendency in the placebo group. NGS-based microbiome analysis demonstrated that the overall structure of the oral microbial community remained stable before and after the intervention. Microbial richness was comparable between time points, and no significant changes were observed in alpha-diversity indices (Shannon and Simpson). Beta-diversity analysis using Bray–Curtis distance indicated high similarity between pre- and post-intervention communities. Furthermore, Pearson correlation analysis revealed strong correlations between paired samples, suggesting the maintenance of ecological stability within the oral microbiome.

4. Conclusion
S. salivarius G7 exhibited inhibitory effects on the growth, biofilm formation, and related gene expression of cariogenic bacteria in in vitro experiments, and in vivo results demonstrated a reduction in cariogenic bacteria along with a tendency toward the maintenance of overall oral microbiome compositional stability. These findings suggest that S. salivarius G7 may selectively suppress pathogenic bacteria without disrupting microbial balance in the oral cavity. Taken together, S. salivarius G7 appears to have potential as an oral probiotic candidate with expected anti-cariogenic effects.

국문 초록 (Abstract)

1. 목 적
본 연구는 구강 프로바이오틱스로서 Streptococcus salivarius G7의 항우식 효과를 규명하고자 하였다. 이를 위해, in vitro 연구에서 S. salivarius G7의 Streptococcus mutans에 대한 항균 및 항바이오필름 활성을 조사하고 그 기전을 분석한 후, 해당 결과를 바탕으로 in vivo 임상 시험을 설계하여 소아의 구강 내 미생물 구성 변화 및 우식 억제 효과에 대해서 평가하였다.

2. 방 법
In vitro 실험에서는 S. salivarius G7의 배양상등액을 이용하여 S. mutans에 대한 항균력 및 바이오필름 형성 억제 효과를 평가하였다. 또한, S. mutans의 glucosyltransferase 유전자(gtfB, gtfC, gtfD) 발현 억제를 real-time quantitative RT-PCR로 정량 분석하였고, 타액 유래 복합 바이오필름 모델을 구축하여 배양상등액 처리에 따른 미생물 구성 변화를 관찰하였다.
서울 강남 소재 소아 치과의원을 내원한 만 3세 이상 만 12세 이하 총 60명을 모집하여 무작위 이중맹검 위약대조군 임상시험을 진행하였다. 시험군은 S. salivarius G7 균주가 포함된 타블렛을 12주간 섭취하였고, 대조군은 유효성분이 없는 타블렛을 동일 조건으로 섭취하였다. 복용 전후 4회에 걸쳐 치태를 채취하여 S. mutans 및 S. salivarius를 real-time PCR (qPCR)로 정량 분석하였으며, 차세대 염기서열분석(Next-Generation Sequencing, NGS) 기반의 shotgun metagenomic sequencing을 통해 구강 내 마이크로바이옴 구성 변화를 평가하였다.

3. 결 과
S. salivarius G7 배양상등액은 S. mutans의 성장을 농도 의존적으로 억제하였으며, 바이오필름 두께 및 생체량을 유의하게 감소시켰다 (p < 0.05). 또한 gtfB, gtfC, gtfD 유전자의 발현이 대조군의 65~80% 수준으로 감소하였고, 타액 유래 복합 바이오필름 내의 S. mutans의 수는 급격히 감소했으며 S. salivarius의 비율은 유의하게 증가했다. 이는 S. salivarius G7이 병원성 세균을 선택적으로 억제하고 공생균의 정착을 촉진하는 항우식 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
임상 시험 결과, 시험군에서는 복용 기간 동안 치태 내 S. mutans의 비율이 유의하게 감소하였고, 치태 내 S. salivarius의 비율은 유의하게 증가하였다. 반면 대조군에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 우식경험치아수(Decayed, Missing and Filled Teeth; DMFT) 점수는 시험군에서 안정적으로 유지되었으나, 대조군에서는 증가 경향을 보였다. Shotgun metagenomic sequencing을 이용한 마이크로바이옴 분석에서는, 복용 전후 구강 내 세균 군집의 전반적인 구조가 안정적으로 유지되었다. 풍부도(richness)는 복용 전후 모두 유사하였으며, 알파 다양도(α-diversity) 지표인 Shannon 및 Simpson 다양도에서도 유의한 변동이 관찰되지 않았다. 또한 베타 다양도(β-diversity) 분석에서, Bray–Curtis 거리(Bray–Curtis distance)는 복용 전후 군집 간 유사성이 높게 유지되었음을 보여주었다. 더불어 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient) 분석에서도 복용 전후 시료 간 높은 상관성이 확인되어 군집의 생태적 안정성이 유지되었음을 시사하였다.

4. 결 론
S. salivarius G7은 in vitro 실험에서 병원성 세균의 성장, 바이오필름 형성 및 관련 유전자 발현을 억제하는 양상을 보였다. 또한 in vivo 연구에서는 우식원성 세균의 비율이 감소하였으며, 구강 마이크로바이옴의 전반적인 분포 양상은 복용 전후 간에 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 이는 S. salivarius G7 복용이 병원성 세균을 선택적으로 억제하면서도, 전체 미생물 군집의 조성에는 뚜렷한 변화를 유발하지 않았음을 보여준다. 따라서 본 연구의 결과를 종합할 때, S. salivarius G7은 항우식 효과를 기대할 수 있는 구강 프로바이오틱스 후보 균주로서의 잠재력을 지닌 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서 론 1
• 제 2 장 문 헌 고 찰 6
• 제 1 절 구강 프로바이오틱스로서의 S. salivarius 6
• 제 2 절 S. salivarius 주요 후보 균주 8
• 제 3 절 Bacteriocin, lantibiotic, salivaricin 14
• 제 3 장 연 구 방 법 18
• 제 1 절 in vitro 연구 방법 18
• 제 2 절 임상 연구대상 모집 및 선정 기준 22
• 제 3 절 임상 연구 방법 25
• 제 4 절 임상 연구 일정 27
• 제 5 절 임상 연구의 기능성 평가 29
• 제 6 절 임상 연구의 분석 방법 32
• 제 4 장 연 구 결 과 36
• 제 1 절 in vitro 연구 결과 36
• 제 2 절 임상 연구 대상자의 기초인구학적 특성 44
• 제 3 절 임상 연구 결과: DMFT 점수 변화 45
• 제 4 절 임상 연구 결과: PCR 결과 48
• 제 5 절 임상 연구 결과: Shotgun metagenomic sequencing 결과 51
• 제 5 장 고 찰 62
• 제 6 장 결 론 71
• 참고문헌 73
• Abstract 91