Single-Cell Analysis on the Initiation of Alternative Lengthening of Telomeres in Mouse Embryonic Stem Cells = 생쥐 배아줄기세포에서 대안적 텔로미어 유지 개시 기전에 대한 단일 세포 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Telomeres, the termini of linear chromosomes, utilize telomerase to maintain their length. While most human somatic cells undergo replicative senescence due to telomere shortening caused by diminished telomerase activity, cancers overcome this barrier by maintaining telomere through either telomerase reactivation or a telomerase-independent mechanism known as Alternative Lengthening of Telomeres(ALT). Previous studies using ALT cancers have expanded the molecular understanding of ALT but could not directly compare the states before and after ALT initiation or illuminate the process of overcoming replicative senescence and telomere crisis. In this study, to gain insights into the initiation process, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) was performed on cell populations flanking the timing of initiation using a telomerase-deficient mouse embryonic stem cell (mESC) ALT model, which contains both pre- and post-acquisition samples. The results revealed transcriptomic heterogeneity in cells undergoing replicative senescence prior to ALT initiation, specifically showing overexpression of genes related to innate immune responses and DNA replication and damage responses. Interestingly, a rare subpopulation comprising cells from both pre- and post-ALT acquisition stages was identified. This group exclusively overexpressed a subset of two-cell (2C) stage genes, including Zscan4—a key factor governing genomic stability and telomere maintenance in mESCs. To investigate whether this expression pattern is driven by telomere shortening, a TRF1-FokI inducible system was established to generate telomere-specific DNA damage. Using this system, I discovered that telomere DNA damage leads to the overexpression of Zscan4. Furthermore, the potential of Zscan4 overexpression to induce de novo telomere DNA synthesis was experimentally confirmed. Transcriptomic analysis following TRF1-FokI and Zscan4 induction confirmed the consistent upregulation of 2C genes including Zscan4. These findings are expected to contribute to a broader understanding of the evolutionarily conserved mechanisms underlying stable telomere and genome maintenance, extending beyond the mESC-specific ALT initiation process.

국문 초록 (Abstract)

선형 염색체의 말단인 텔로미어는 세포 분열에 따른 지속적인 길이 감소를 해결하기 위해 텔로머레이즈로 길이를 유지한다. 대부분의 인간 체세포는 텔로머레이즈의 활성이 줄어 텔로미어 길이 감소에 따른 복제 노화를 겪지만 암세포는 텔로머레이즈 재활성 또는 텔로머레이즈 비의존적인 방식의 대안적 텔로미어 길이 유지(Eckersley-Maslin et al.)를 통해 복제 노화를 극복한다. 기존에 수행된 암세포주를 통한 ALT 연구는 ALT의 분자적인 이해를 넓혔지만 ALT 기전 개시 전과 후를 직접 비교하거나 복제 노화 및 텔로미어 위기 극복 과정을 조명할 수 없었다. 본 연구에서는 ALT 획득 전후 샘플이 모두 존재하는 텔로머레이즈가 결손된 생쥐 배아줄기세포(mESC) ALT 모델을 통해 개시 과정의 정보를 얻기 위해 개시 직전과 직후 세대의 세포를 단일 세포 전사체 분석(scRNA-seq)을 수행했다. 그 결과 ALT 개시 전 복제 노화를 겪는 세포들의 이질성을 확인했으며, 유형 1 인터페론 반응을 포함한 선천성 면역 반응 그리고 DNA 복제 및 손상 반응 유전자들이 과발현했다. 흥미로운 점은 ALT 획득 전후 세포가 골고루 포함된 소수의 세포군을 발견했으며, 이 세포군은 mESC 유전체 안정성 및 텔로미어 길이 유지를 관장하는 핵심 인자인 Zscan4를 포함하여 2세포기 유전자 일부를 배타적으로 과발현 하였다. 이런 발현 패턴이 텔로미어 길이 감소로 인한 것인지를 규명하고자 텔로미어 특이적인 DNA 손상을 유발하는 TRF1-FokI 유도 시스템을 확립했으며, 해당 시스템의 발현을 통해 텔로미어 DNA 손상이 Zscan4의 과발현으로 이어지는 현상을 발견했다. 그리고 Zscan4의 과발현이 새로운 텔로미어 DNA 합성을 유발할 수 있는 가능성을 실험적으로 확인하였다. TRF1-FokI 및 Zscan4 유도 시 발생하는 전사체 변화에서 Zscan4를 포함한 2세포기 유전자 발현량 상승의 일관성을 확인하였다. 본 연구 결과는 mESC 특이적인 ALT 개시 과정을 넘어서 진화적으로 보존된 텔로미어와 유전체의 안정적인 유지 기전을 이해하는데 기여할 것으로 기대한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents iii
• List of Figures vii
• List of Tables x
• Introduction 1
• Telomere - Evolutionary conserved genome protection strategy 2
• Telomere shortening replicative senescence 4
• Diversity of telomere maintenance mechanism 5
• Molecular feature of ALT 7
• Putative molecular mechanisms of ALT 8
• Zscan4: A Mouse ES cell-specific telomere protection factor 11
• Significance of this study 14
• Materials and Methods 16
• Results 27
• ALT acquisition – Prerequisite for escaping telomere crisis 28
• Comparative single-cell transcriptome analysis of two populations flanking the telomere crisis 29
• Identification of a distinct cell population undergoing replicative senescence34
• Single-cell profiling reveals global transcriptomic divergence in type 2 ALT mESCs and 2C-like identity of the transitional cluster 36
• Identification of clusters heterogeneity through specific marker gene expression 40
• GSEA reveals distinct features comparing pre- and post-crisis clusters 42
• Characterization of transitional cluster as a putative subpopulation undergoing mESC-specific replicative senescence 51
• Establishment of telomere double strand break induction system 58
• TRF1-FokI system is a relevant model for inducing telomere DNA damage. 61
• Telomere DNA damage upregulates Zscan4 expression in mouse ES cells……… 64
• Break-induced telomere synthesis is Zscan4-dependent in pre-ALT mouse ES cells……… 70
• Comparative transcriptomic profiling of Zscan4 perturbation and telomere DNA damage in postALT cells 73
• PostALT cells exhibit transcriptomic sensitivity to telomere DNA damage and Zscan4 overexpression 75
• Transitional cluster features in response to telomeric perturbation 80
• Features of perturbation in PD800 cells 83
• Intersection analysis reveals putative ALT factors associated with the Zscan4-mediated response to telomere shortening 85
• Discussion 88
• Single-cell transcriptomics unveils feature of telomere shortening events 89
• Identification of a novel cell population undergoing telomere crisis 91
• Zscan4: A Putative Prerequisite for Surviving Telomere Crisis 92
• PreALT cells were insensitive to TRF1-FokI inducing telomere damage 95
• Upregulation of Zscan4 recapitulates the transcriptomic profile of transitional cluster……. 101
• Experimental limitations and Remaining questions 104
• Conclusion and perspectives 109
• References 112
• 국문 초록 123