Selective Sensitivity of Varroa Mites to Coumaphos Driven by Elevated Oxidative Bioactivation Metabolism in the Nervous System = 신경계 내의 산화적 생활성 대사 증가에 기인한 꿀벌응애의 쿠마포스에 대한 선택적 감수성

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The western honey bee (Apis mellifera) provides essential pollination services for modern agriculture, yet its sustainability is increasingly jeopardized by the ectoparasitic mite Varroa destructor, which feeds on host fat bodies and transmits pathogens such as deformed wing virus. In-hive control currently relies on a limited set of synthetic acaricides, fluvalinate, amitraz, and coumaphos, that demonstrate high selectivity for mites relative to honey bees. Among these, coumaphos exhibits strong mite-selective toxicity; however, the mechanistic basis underlying its selective toxicity has remained unresolved.
To elucidate this selectivity, we quantified the relative toxicodynamic and metabolic contributions of coumaphos in both species. Acute bioassays revealed that coumaphos was 810-fold more toxic to Varroa mites than to honey bees, far exceeding the 12.1-fold difference observed for malathion. Surprisingly, inhibition assays using recombinantly expressed acetylcholinesterases (AChEs) showed that the major honey bee esterase (AmAChE2) was 62–78 times more sensitive to the toxic metabolite coumaphos-oxon than mite AChEs, indicating that reduced target-site sensitivity cannot explain bees’ lower susceptibility.
Given this discrepancy, this study investigated metabolic drivers of coumaphos selectivity using comparative cytochrome P450 (P450) phylogenetics, tissue-specific expression profiling, and molecular docking analyses. These approaches identified several mite P450s with neural enrichment and strong predicted affinity for coumaphos, implicating them in toxic bioactivation, whereas homologous bee P450s favored detoxification-associated scaffolds.
To exploit this metabolic asymmetry, dietary aromatic phytochemicals were screened for their ability to induce putative mite bioactivation enzymes. Quercetin, a major flavonoid naturally present in pollen and honey, induced VdCYP4EP4 expression most strongly, followed by 3-chlorocoumarin. Topical and oral pretreatment with quercetin significantly enhanced coumaphos-induced mite mortality while reducing honey bee mortality, consistent with quercetin’s known role in boosting detoxification (e.g., AmCYP6AS and AmCYP9Q enzymes).
Finally, overwintering field trials demonstrated that quercetin-supplemented colonies treated with coumaphos exhibited the highest daily mite drop and improved bee physiological condition relative to controls. These results establish that divergent metabolic processing, rather than target-site insensitivity, underlies coumaphos selectivity and that nutritional modulation of xenobiotic metabolism can be used to increase the efficacy and safety of acaricide treatment in apiculture.

국문 초록 (Abstract)

쿠마포스는 현재 양봉 산업에서 꿀벌응애(Varroa destructor) 방제를 위해 널리 사용되는 살비제로, 꿀벌에 비해 응애에 높은 선택독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 선택독성이 어떠한 생리적·분자적 기작에 기인하는지 명확히 규명되지 않았다. 본 연구는 쿠마포스 선택독성의 분자 기작 규명을 위해 선택독성의 근간을 이루는 표적 효소의 감수성 차이 및 선택적 대사 기작을 중심으로 꿀벌과 꿀벌응애 간 비교 연구를 수행하였다.
먼저 쿠마포스의 작용점인 아세틸콜린에스터레이즈(AChE)의 민감도를 비교하였다. 분석 결과, 꿀벌의 AChE가 꿀벌응애보다 오히려 높은 민감도를 보임으로써 선택독성이 표적 효소의 감수성 차이에 기인한다는 가설을 기각할 수 있었다. 두 종 간의 선택독성차이는 표적 자체가 아닌 쿠마포스의 체내 대사 경로의 차이에서 비롯된 것으로 가설을 전환하였다. 이를 검증하기 위해 꿀벌과 꿀벌응애의 체내에서 쿠마포스 처리 후 시간에 따른 대사체 생성비율을 비교하였다. 분석 결과, 꿀벌응애에서는 쿠마포스가 높은 비율로 독성이 강화된 옥손체(oxon body)로 전환되는 반면, 꿀벌에서는 상대적으로 전환 효율이 낮고 비독성 대사경로가 주로 활성화되어 있었다. 이러한 결과는 꿀벌응애에서 쿠마포스가 독성 활성화대사(bioactivation)를 통해 더욱 치명적으로 전환된다는 것을 시사하였다. 추가적으로 다양한 무독화효소 저해제를 활용하여 대사 경로에 관여하는 효소군을 추적하였다. 그 결과, 사이토크롬 P450 저해제가 처리된 꿀벌응애에서는 사충률이 감소하는 역전 현상이 나타났으며, 이는 P450이 일반적으로 해독을 담당한다는 기존 개념과 달리 응애에서는 오히려 독성을 활성화시키는 생활성대사 효소로 사실을 시사하였다. 반면, 꿀벌에서는 P450 억제 시 사충률 증가 또는 독성 상승 경향이 나타나, 꿀벌은 P450을 이용하여 독성을 낮추는 해독 중심의 대사를 수행함을 확인하였다. 이후 꿀벌과 꿀벌응애의 전체 P450 유전자군을 비교하여 해독형 및 생활성형 후보군을 분류하고 조직별 발현양상을 분석하였다. 그 결과, 꿀벌에서는 해독형 P450이 신경계에 주로 분포하는 반면, 꿀벌응애에서는 쿠마포스 생활성화에 관여하는 후보 P450이 신경조직에 집중적으로 발현되어 있음을 확인하였다. 특히 응애 유래 VdCYP4EP4는 대표적 신경조직인 신경결절(synganglion)에서 특이적으로 높은 발현을 보였으며, 재조합 단백질을 이용한 기능 검정에서도 쿠마포스를 높은 효율로 쿠마포스옥손(coumaphos-oxon)으로 전환하였다. 이는 선택독성이 조직 특이적 효소 발현과 대사 효율 차이의 결합에 의해 발생한다는 점을 분명히 보여준다.
더불어, 본 연구에서는 이러한 선택적 생활성화 기작을 이용하여 실질적인 방제 전략을 제시하고자 하였다. 구조적 유사체를 탐색하여 꿀벌응애의 VdCYP4EP4 활성화를 유도할 수 있는 후보 물질을 분석한 결과, 퀘르세틴(quercetin) 및 3CLC가 응애 사망률을 유의미하게 증가시켰으며, 이는 퀘르세틴을 협력제로 활용할 수 있음을 시사하였다. 더불어 P450 발현 기반 스크리닝 플랫폼을 구축하고 신규 약제를 평가한 결과, 쿠마포스와 유사하게 생활성 대사에 의존할 가능성이 있는 차세대 살비제 후보군을 확인하였다. 종합하면, 본 연구는 쿠마포스 선택독성이 해독형과 생활성형 대사의 경쟁적 균형에 의해 결정되며, 특히 꿀벌응애의 신경계에서 P450에 의해 촉진되는 독성 활성화 대사가 핵심 기작임을 규명하였다. 나아가 이러한 대사 차이를 이용한 방제 전략의 실용적 가능성을 제시함으로써, 양봉 산업에서 보다 안전하고 지속가능한 꿀벌응애 방제 기술 개발에 기여할 수 있는 과학적 기반을 마련하였다는 점에서 높은 의의를 가진다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT i
• ABBREVIATIONS v
• CONTENTS vi
• LIST OF TABLES xii
• LIST OF FIGURES xiv
• GENERAL INTRODUCTION 1
• 1. Study insects: Apis mellifera and Varroa destructor 1
• 2. Acaricide resistance of Varroa mites 2
• 3. Mechanisms underlying the selective toxicity of acaricides to Varroa mites 3
• 4. Introduction of chapters 5
• CHAPTER I. Molecular and metabolic analysis to elucidate the selective sensitivity of coumaphos on Varroa mites 8
• Abstract 9
• 1. Introduction 10
• 2. Materials and Methods 13
• 2.1. Chemicals 13
• 2.2. Preparation of honey bee and Varroa mites 13
• 2.3. Toxicity of coumaphos on honey bees and Varroa mites 14
• 2.4. Differential sensitivity of AChEs to coumaphos oxon 16
• 2.5. Synergist bioassay 18
• 2.6. LC-MS/MS sample preparation 19
• 2.7. LC-MS/MS instrumental conditions and analysis 23
• 2.8. Statistics 25
• 3. Results 26
• 3.1. Coumaphos and malathion show selective toxicity toward Varroa mites 26
• 3.2. Organophosphate oxons exhibit differential toxicity toward honey bee and Varroa AChEs 27
• 3.3. Synergists modulate coumaphos toxicity in Varroa mites 32
• 3.4. Coumaphos and malathion display distinct in vivo metabolic profiles 33
• 4. Discussion 38
• 5. Conclusion 42
• 6. Appendix 43
• CHAPTER II. Functional divergence of P450s underlying coumaphos selectivity in honey bees and Varroa mites 47
• Abstract 48
• 1. Introduction 49
• 2. Materials and Methods 52
• 2.1. Comparative phylogeny of P450s 52
• 2.2. Chemicals 52
• 2.3. Functional expression of P450s 53
• 2.4. Coumaphos metabolism by honey bee and Varroa mite cytochrome P450s 55
• 2.5. Tissue-specific expression profiling of P450 genes in the honey bee and Varroa mite 57
• 2.6. Molecular docking analysis 60
• 2.7. In vitro screening of alternative acaricide 61
• 2.8. Statistical Analysis 62
• 3. Results 63
• 3.1. Comparative phylogeny of P450s in the honey bee and Varroa mite 63
• 3.2. Coumaphos metabolism dynamics by recombinant P450s from honey bees and Varroa mites 66
• 3.3. Tissue-specific expression patterns of P450 genes in the honey bee and Varroa mite 71
• 3.4. Molecular docking 76
• 3.5. In vitro screening of proinsecticides as potential alternative acaricides 79
• 4. Discussion 81
• 5. Conclusion 86
• 6. Appendix 88
• CHAPTER III. Exploitation of Varroa–specific oxidative metabolism for the discovery of novel synergists enhancing coumaphos toxicity 89
• Abstract 90
• 1. Introduction 92
• 2. Materials and Methods 95
• 2.1. Honey bees and Varroa mites 95
• 2.2. Coumaphos and inducer candidates 96
• 2.3. Administration methods 97
• 2.4. New designs of Varroa feeding chamber for oral pretreatment of inducer candidates 99
• 2.5. Induction of putative coumaphos-bioactivating P450s 103
• 2.6. Bioassay of coumaphos on inducer-pretreated honey bees and Varroa mites 105
• 2.7. In-hive treatment of quercetin and coumaphos 107
• 2.8. Expression profiling of P450 marker genes for quercetin- and coumaphos-treated colonies 110
• 2.9. Statistical analysis 110
• 3. Results 112
• 3.1. Induction of P450 gene expression following phytochemical treatment 112
• 3.2. Changes in coumaphos toxicity in honey bees and Varroa mites following phytochemical treatment 115
• 3.3. Effects of quercetin oral pretreatment on coumaphos toxicity to Varora mites 118
• 3.4. In-hive efficacy and safety of coumaphos-quercetin co-application 120
• 3.5. Effects of long-term in-hive treatment on P450 and biomarker gene expression in honey bees 125
• 4. Discussion 128
• 5. Conclusion 132
• 6. Appendix 133
• GENERAL CONCLUSION 135
• LITERATURES CITED 138
• KOREAN ABSTRACT 143