Patient-derived organoid-CAF co-culture model identifies IL-6/STAT3 as a therapeutic target to overcome chemoresistance in pancreatic cancer = 환자 유래 오가노이드-암연관섬유아세포(CAF) 공배양 모델을 통한 췌장암 항암제 내성 극복의 IL-6/STAT3 치료 표적 규명

국문 초록 (Abstract)

1. 연구 배경 및 목적
췌장관선암(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 강한 화학요법 내성으로 인해 여전히 가장 치명적인 악성 종양 중 하나이다. 암연관섬유아세포(cancer-associated fibroblasts, CAFs)는 종양미세환경의 핵심 구성 요소로서, 다양한 사이토카인 매개 신호전달 경로를 통해 PDAC의 진행과 치료 저항성에 중요한 역할을 한다. 그러나 CAFs가 PDAC에서 화학요법 내성을 유도하는 구체적인 분자적 기전은 아직 충분히 규명되지 않았다. 본 연구의 목적은 CAF-유도 화학요법 내성에 관여하는 핵심 신호전달 경로를 규명하고, 이를 표적으로 하는 치료 전략의 가능성을 탐색하는 데 있다.

2. 연구 방법
환자유래 췌장암 오가노이드(patient-derived pancreatic cancer organoids, PDOs)와 CAFs를 이용한 직접적인 3차원 공배양 시스템을 구축하여, 섬유아세포 구획이 gemcitabine 및 STAT3 억제제(Stattic)에 대한 약물 반응성에 미치는 영향을 분석하였다. PDOs와 CAFs 간의 공간적 상호작용은 면역형광 염색을 통해 시각화하였다. 공배양 시스템에서의 사이토카인 분비 양상은 multiplex bead assay를 이용하여 분석하였으며, PDO의 분자적 변화는 qPCR 및 Western blot을 통해 평가하였다. 세포 생존율과 약물 반응은 CellTiter-Glo® 3D assay와 면역형광 염색으로 분석하였다. 약물 병용 효과는 CompuSyn 프로그램을 사용하여 평가하였고, 통계 분석은 Student’s t-test 또는 two-way ANOVA를 이용하였다.

3. 연구 결과
CAFs와 공배양된 PDOs는 gemcitabine에 대해 유의하게 증가된 내성을 보였으며, 이는 세포 생존율 분석과 면역형광 염색을 통해 확인된 직접적인 3차원 종양–기질 상호작용에 의해 뒷받침되었다. PDO-CAF 공배양에서 수행한 사이토카인 프로파일링 결과, IL-6가 가장 높은 수준으로 발현된 사이토카인으로 확인되었다. qPCR 분석에서는 IL-6 수용체(IL6R) mRNA의 기저 발현 수준이 유의하게 증가하였으며(SNU-4894-TO, p<0.01; SNU-9286-TO, p<0.01; SPDO-26, p<0.001; SPDO-27, p<0.001), Western blot 분석을 통해 IL-6 처리 후 STAT3 활성화가 확인되었다. IL-6/STAT3 신호전달 경로를 표적으로 하기 위해 STAT3 억제제를 gemcitabine과 병용 투여한 결과, gemcitabine 단독 처리 대비 PDO 단독 배양 및 PDO-CAF 공배양 모델 모두에서 약물 내성이 유의하게 감소하였다(p<0.05). 또한 CI 분석 결과, STAT3 억제제와 gemcitabine 간의 강한 상승 효과(CI < 0.1)가 확인되어, STAT3의 약리학적 차단이 CAF-유도 화학요법 내성을 효과적으로 극복함을 보여주었다.

4. 결론
본 연구는 IL-6/STAT3 신호전달 경로가 PDAC에서 CAF-유도 화학요법 내성의 핵심 매개체임을 규명하였다. STAT3 억제제와 gemcitabine의 병용 요법은 공배양 모델에서 화학요법 감수성을 유의하게 향상시켰으며, 이는 PDAC의 약물 내성을 극복하기 위한 유망한 치료 전략이 될 수 있음을 시사한다. 본 연구 결과는 췌장암 치료 효능을 개선하기 위해 CAF-유래 신호전달 경로를 표적으로 하는 치료 접근법의 잠재적 가치를 강조한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

1. Background/aims
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains one of the most lethal malignancies, primarily due to profound chemoresistance. Cancer-associated fibroblasts (CAFs) play a crucial role in the tumor microenvironment, contributing to PDAC progression and therapeutic resistance through various cytokine-mediated signaling pathways. Despite advances in cancer therapy, the specific mechanisms by which CAFs promote chemoresistance in PDAC remain incompletely understood. This study aimed to identify critical signaling pathways involved in CAF-induced chemoresistance and explore their potential as therapeutic targets to enhance treatment efficacy in PDAC.

2. Methods
We established direct 3D co-culture system of patient-derived pancreatic cancer organoids (PDOs) and CAFs to investigate the effect of the fibroblastic compartment on gemcitabine and STAT3 inhibitor (Stattic) sensitivity. Spatial interactions between PDOs and CAFs were visualized by immunofluorescence staining. Cytokine profiling in the co-culture was performed using multiplex bead assays. PDO molecular changes were analyzed via qPCR and Western blot. Cell viability and drug responses were assessed using the CellTiter‑Glo® 3D assay and immunofluorescence staining. Combination effects were evaluated using the CompuSyn program. Statistical significance was determined using Student’s t-test or two-way ANOVA.

3. Results
PDOs co-cultured with CAFs exhibited significantly increased resistance to gemcitabine, supported by cell viability assays and immunofluorescence staining that confirmed direct 3D tumor–stroma interactions. Cytokine profiling of the PDO-CAF co-culture revealed IL-6 as the most highly expressed cytokine. qPCR analysis showed upregulated IL-6 receptor (IL6R) mRNA basal levels (SNU-4894-TO, p<0.01; SNU-9286-TO, p<0.01; SPDO-26, p<0.001; SPDO-27, p<0.001), and western blot analysis confirmed STAT3 activation following IL-6 treatment. To target the IL-6/STAT3 pathway, we employed a STAT3 inhibitor in combination with gemcitabine. This combination significantly reduced drug resistance in both PDO monocultures and PDO-CAF co-cultures compared to gemcitabine alone (p<0.05). The CI analysis indicated strong synergism (CI < 0.1) between the STAT3 inhibitor and gemcitabine, indicating that pharmacological blockade of STAT3 effectively overcame CAF-induced chemoresistance.

4. Conclusions
This study identifies the IL-6/STAT3 signaling pathway as a key mediator of CAF-induced chemoresistance in PDAC. The combination of a STAT3 inhibitor with gemcitabine significantly enhanced chemosensitivity in our co-culture model, suggesting a promising strategy for overcoming drug resistance in PDAC. These findings highlight the therapeutic potential of targeting CAF-derived signaling pathways to improve treatment efficacy in pancreatic cancer.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1-3
• Chapter 2. Materials and Methods 4-11
• 1. Establishment of patient-derived pancreatic cancer organoids 4-5
• 2. Isolation and culture of CAFs 5-6
• 3. Transduction and Immortalization of CAFs 6
• 4. 3D co‑culture and Cytokine Analysis of PDOs and CAFs 6-7
• 5. CellTiter‑Glo® 3D assay 7-8
• 6. IL-6 stimulation and Drug treatment 8
• 7. Immunofluorescence staining of monocultures and co-cultures 8-9
• 8. qPCR 9-10
• 9. Western blotting 10
• 10. Statistics 11
• Chapter 3. Results 12-25
• 1. Establishment of 3D co-culture model using hTERT-immortalized cancer-associated fibroblasts (CAFs) and patient-derived pancreatic cancer organoid (PDO) 12-14
• 2. 3D co-culture of TERT-immortalized cancer-associated fibroblasts (CAFs) and patient-derived pancreatic cancer organoids (PDOs) increase drug resistance 15-16
• 3. Secretion of IL-6 from CAFs activates STAT3 in Patient-derived pancreatic cancer organoids 17-20
• 4. IL-6/STAT3 signaling regulates viability and enhances chemosensitivity in PDOs and PDO-CAF co-culture model treated with gemcitabine and STAT3 inhibitor 21-25
• Chapter 4. Discussion 26-29
• Chapter 5. Conclusion 30
• Abstract(Korean) 32-33
• References 34-37
• [Table 1] 14
• [Table 2] 25
• [Figure 1A,1B,1C] 13-14
• [Figure 2A,2B,2C] 16
• [Figure 3A,3B,3C,3D,3E] 19-20
• [Figure 4A,4B,4C,4D,4E] 23-25
• [Figure 5] 30
• [Supplement Figure 1A,1B] 31
• [Supplement Figure 2A,2B,2C] 31