Novel Aqueous Optical Clearing Methods for High-Resolution Three-Dimensional Imaging of Neuronal and Vascular Structures = 신경 및 혈관 구조의 고해상도 3차원 영상화를 위한 새로운 수용액 기반 광학 투명화 기법에 대한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Three-dimensional (3D) volume imaging of intact biological tissues has become increasingly important in biomedical research, yet optical heterogeneity of tissue components creates opacity that limits deep tissue visualization. While various tissue clearing techniques have been developed to address this challenge, each method faces distinct limitations including insufficient transparency, prolonged processing time, tissue deformation, fluorescence quenching, or complex protocols. This thesis presents two complementary optical clearing solutions that I developed to overcome these limitations through optimized formulations.
First, I developed OptiMuS (Optimized single-step optical clearing Method that preserves fluorescence and Size), a simple refractive index (RI) matching solution combining iohexol (75%), urea (4 M), and D-sorbitol (10%). OptiMuS achieves rapid clearing of brain tissues and intact organs (1-mm rat brain in 1.5 hours) with minimal size change (0.93 ± 1.1% shrinkage) while preserving over 90% of endogenous fluorescence signals for at least 4 days. The method outperforms existing aqueous-based clearing techniques in transparency, clearing speed, and size preservation. OptiMuS is fully compatible with lipophilic dyes such as DiI, enabling 3D visualization of vascular structures in whole brain, kidney, spleen, and intestine. Combined with automated 3D morphological analysis software (DXplorer), OptiMuS facilitates quantitative comparative analysis of DiI-labeled glomerular structures in normal and diseased kidneys.
Second, to address the limitations of OptiMuS for deep tissue immunostaining, I developed OptiMuS-prime, a novel passive tissue clearing method that replaces traditional sodium dodecyl sulfate (SDS) with sodium cholate (SC, 10%) combined with urea (4 M) and D-sorbitol (10%). SC, a bile salt detergent with smaller micelles (aggregation number 4-16) and higher critical micelle concentration (14 mM) compared to SDS, provides efficient delipidation while minimizing protein denaturation. The addition of urea synergistically enhances tissue penetration through hyperhydration and hydrogen bond disruption. Through Coomassie blue penetration assays, I demonstrated that OptiMuS-prime exhibits superior delipidation efficiency compared to conventional detergents and enables successful immunostaining of various mouse organs (brain, heart, kidney, lung, intestine, spleen) with multiple antibodies (anti-α-SMA, anti-TH, anti-GFAP, anti-Tuj1, anti-NeuN, anti-Iba-1). I successfully applied the method to clear and immunostain challenging samples including whole rat brains (7 days), densely packed post-mortem human tissues (3-5 mm blocks in 4 days), and human induced pluripotent stem cell-derived brain organoids at various developmental stages (D16, D21, D50), enabling single-cell resolution 3D imaging throughout entire tissue depths.
Both methods utilize biocompatible aqueous reagents, require no specialized equipment, and maintain tissue architectural integrity while enabling high-resolution 3D visualization of cellular and subcellular structures. OptiMuS provides a fast, simple RI-matching solution ideal for tissues with preserved endogenous fluorescence or lipophilic dye labeling, while OptiMuS-prime offers comprehensive passive clearing, delipidation, and immunostaining capabilities for diverse biological samples. Together, these complementary approaches provide accessible, versatile solutions for section-free 3D imaging across multiple spatial scales—from whole organisms to individual cells—making advanced tissue clearing technology widely applicable without requiring extensive technical expertise.

국문 초록 (Abstract)

생물학적 조직의 3차원(3D) 부피 영상화는 생의학 연구에서 점점 더 중요해지고 있으나, 조직 구성 성분의 광학적 불균질성으로 인한 불투명성이 깊은 조직 가시화를 제한한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 조직 투명화 기술이 개발되었지만, 각 방법은 불충분한 투명도, 긴 처리 시간, 조직 변형, 형광 소실 또는 복잡한 프로토콜과 같은 뚜렷한 한계에 직면해 있다. 본 학위논문은 최적화된 제형을 통해 이러한 한계를 극복하는 두 가지 상호 보완적인 광학 투명화 솔루션을 제시한다.
첫째, iohexol (75%), urea (4 M), 그리고 D-sorbitol (10%)을 결합한 단순한 굴절률(RI) 매칭 용액인 OptiMuS (Optimized single-step optical clearing Method that preserves fluorescence and Size)를 개발하였다. OptiMuS는 뇌 조직 및 온전한 장기의 빠른 투명화를 달성하며(1-mm 두께 쥐 뇌를 1.5시간 내), 최소한의 크기 변화(0.93 ± 1.1% 수축)로 내재 형광 신호의 90% 이상을 최소 4일간 보존한다. 이 방법은 투명도, 투명화 속도 및 크기 보존 측면에서 기존의 수용액 기반 투명화 기술을 능가한다. OptiMuS는 DiI와 같은 친지질성 염료와 완전히 호환되어 전체 뇌, 신장, 비장 및 장의 혈관 구조를 3D로 시각화할 수 있다. 자동화된 3D 형태학적 분석 소프트웨어(DXplorer)와 결합하여, OptiMuS는 정상 및 질환 신장에서 DiI로 표지된 사구체 구조의 정량적 비교 분석을 가능하게 한다.
둘째, 깊은 조직 면역염색에 대한 OptiMuS의 한계를 해결하기 위해, 전통적인 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 sodium cholate (SC, 10%)로 대체하고 urea (4 M) 및 D-sorbitol (10%)과 결합한 새로운 수동적 조직 투명화 방법인 OptiMuS-prime을 개발하였다. SC는 SDS에 비해 더 작은 미셀(응집 수 4-16)과 더 높은 임계 미셀 농도(14 mM)를 가진 담즙산염 세제로서, 단백질 변성을 최소화하면서 효율적인 탈지질화를 제공한다. Urea의 추가는 과수화 및 수소 결합 파괴를 통해 조직 투과를 상승적으로 향상시킨다. Coomassie blue 투과 분석을 통해, OptiMuS-prime이 기존 세제들에 비해 우수한 탈지질화 효율을 나타내며, 다양한 항체(anti-α-SMA, anti-TH, anti-GFAP, anti-Tuj1, anti-NeuN, anti-Iba-1)를 사용한 여러 마우스 장기(뇌, 심장, 신장, 폐, 장, 비장)의 성공적인 면역염색을 가능하게 함을 입증하였다. 전체 쥐 뇌(7일), 밀집된 사후 인간 조직(4일 내 3-5 mm 블록), 그리고 다양한 발달 단계(D16, D21, D50)의 인간 유도만능줄기세포 유래 뇌 오가노이드를 포함한 어려운 샘플들을 투명화하고 면역염색하는 데 이 방법을 성공적으로 적용하여, 전체 조직 깊이에 걸쳐 단일 세포 해상도의 3D 영상화를 가능하게 하였다.
두 방법 모두 생체 적합성 수용액 시약을 사용하고, 특수 장비가 필요하지 않으며, 조직 구조의 완전성을 유지하면서 세포 및 세포 소기관 구조의 고해상도 3D 시각화를 가능하게 한다. OptiMuS는 보존된 내재 형광 또는 친지질성 염료 표지를 가진 조직에 이상적인 빠르고 단순한 RI 매칭 솔루션을 제공하는 반면, OptiMuS-prime은 다양한 생물학적 샘플에 대한 포괄적인 수동 투명화, 탈지질화 및 면역염색 능력을 제공한다. 이러한 상호 보완적 접근법들은 전체 생물체에서 개별 세포에 이르기까지 여러 공간 규모에 걸친 절편 없는 3D 영상화를 위한 접근 가능하고 다목적인 솔루션을 제공하여, 광범위한 기술적 전문 지식 없이도 고급 조직 투명화 기술을 널리 적용 가능하게 한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of contents iii
• List of Figures and Tables iv
• Introduction 1
• Material and Methods 3
• Result
• Part I. OptiMuS 13
• Part II. OptiMuS-prime 20
• Part III. Applications 28
• Discussion 90
• Reference 96
• Abstract in Korean 103
• Acknowledgements 105