Neural-induced human mesenchymal stem cells improve functional recovery of acute spinal cord injury through attenuating astrogliosis = 신경세포 유도 인간 중간엽 줄기세포의 성상교세포증 억제를 통한 급성 척수 손상 기능 회복 개선 연구

국문 초록 (Abstract)

연구 목적: 성상교세포증 (Astrogliosis)은 척수 손상 회복을 억제하는 주요 기전 중의 하나이다. 대부분의 초기 척수 손상 연구들은 성상교세포증을 억제하는 데 초점을 맞추었다. 그러나 최근 여러 연구에서 성상세포의 파괴적인 역할 외에 흉터 형성을 감소시키고 축삭 재생을 촉진하는, 신경 보호의 역할도 수행함을 밝혀냈다. 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem Cells, MSCs)는 척수 손상 치료를 위한 치료 후보로 광범위하게 연구되어 왔지만, 성상교세포증 조절에서 MSCs의 역할은 잘 알려지지 않았다. 본 연구는 신경 유도 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Neuronal Induced-human Adipose tissue Derived Stem Cells, NI-hADSCs)가 척수 손상 회복을 촉진하기 위해 성상교세포증을 어떻게 조절하는지 규명하는 것을 목표로 하였다.
연구 방법: 급성 중증 척수 손상 백서 모델에서 척수 손상 병변 상방 5mm 위치 척수에 NI-hADSCs를 이식하였다. 백서의 기능 회복은 Basso-Beattie-Bresnahan 운동 평가 척도를 사용하여 수술 후 1일부터 시작하여 이후 6주 동안 매주 연속적으로 평가하였다. 손상 후 6주 시점에서 교세포증 표지자와 신경염증 경로의 단백질 수준을 평가하기 위해 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석을 수행하였다. 성상교세포증과 성상세포 표현형 변화를 평가하기 위해 손상 후 6주 시점에서 조직병리학적 검사를 실시하였다.
연구 결과: NI-hADSCs 이식은 MSC 치료군에서 백서 하지의 신경학적 기능을 개선시켰다. 손상 후 6주 시점에서 NI-hADSCs 치료군에서는 교세포 섬유성 산성 단백질(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP), 비멘틴(vimentin), 그리고 보체 성분 3(C3)의 수준이 현저하게 감소하였다. 반면, 신호 변환 및 전사 활성인자 3((Signal Transducer and Activator of Transciption 3, STAT3)/인산화 STAT3 단백질의 수준은 현저하게 증가하였다. 그러나, S100 칼슘 결합 단백질 A10 (S100 Calcium-binding protein A10)과 핵인자 카파 B (Nuclear Factor kappa B, NF-κB)/인산화 NF-κB는 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 면역조직화학 분석은 성상교세포증의 감소와 C3를 발현하는 성상세포 수의 감소를 보여주었다. 그러나 이러한 효과는 NI-hADSCs를 이식하였던, 병변 주변 척수의 배측 부분에 국한되었다. B-세포 림프종-2 (Bcl-2) 발현의 상당한 증가와 Bcl-2 연관 X (Bax) 단백질 발현의 감소는 NI-hADSC 치료가 신경세포 사멸 (apoptosis)을 감소시켰음을 나타냈다.
결 론: NI-hADSCs 이식은 성상교세포증을 조절함으로써 척수 손상에서 기능 회복을 개선시켰다. 성상교세포증의 조절은 잠재적으로 STAT3 신호전달을 통해 유해한 A1 성상세포의 억제에 의해 이루어진 것으로 추정된다. 그러나 성상교세포증에 대한 NI-hADSCs의 보호 효과는 병변 주변 영역으로 공간적으로 제한되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objective: Astrogliosis is known as a major mechanism that inhibits recovery from spinal cord injury (SCI). Most earlier studies had focused on inhibiting astrogliosis in SCI treatment. However, recent studies have revealed its protective role in reducing scar formation and promoting axonal regeneration. Although mesenchymal stem cells (MSCs) have been widely studied as therapeutic candidates for SCI treatment, the role of MSCs in astrogliosis modulation remains unclear. This study aimed to determine how neural-induced human adipose-derived MSCs (NI-hADSCs) modulate astrogliosis to promote SCI repair.
Methods: NI-hADSCs were transplanted into the peri-lesional spinal cord in an acute severe SCI rat model. Functional recovery was evaluated serially at postoperative day 1 and weekly thereafter for 6 weeks using the Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) locomotor rating scale. Western blot analysis was performed to assess protein levels of gliosis markers and neuroinflammatory pathways at 6 weeks post-injury. Histopathological examination was conducted at 6 weeks post-injury to evaluate astrogliosis and astrocyte phenotypic changes.
Results: Transplantation of NI-hADSCs improved the functional outcomes in the MSC-treated group. At six weeks post-injury, the levels of glial fibrillary acidic protein, vimentin, and complement component 3 (C3) in the NI-hADSC-treated group were markedly decreased, whereas the levels of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)/phosphorylated STAT3 proteins were markedly increased. The levels of S100 calcium-binding protein A10 and nuclear factor kappa B (NF-κB)/phosphorylated NF-κB expression showed no significant differences between groups. Immunohistochemical analysis revealed decreased astrogliosis and a reduced number of C3-expressing astrocytes. However, these effects were limited to the dorsal aspect of the perilesional spinal cord. Substantially increased B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) expression and decreased Bcl-2-associated X protein expression indicated that NI-hADSC treatment reduced neuronal apoptosis.
Conclusion: NI-hADSCs transplantation improved functional recovery in SCI by modulating astrogliosis. The modulation of astrogliosis was achieved through suppression of detrimental A1 astrocytes, potentially via STAT3 signaling. However, the protective effect of NI-hADSCs on astrogliosis diminished during the subacute SCI period and was spatially restricted to the peri-lesional area.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• 1. Epidemiology of Traumatic Spinal Cord Injury 1
• 2. Pathophysiology of SCI 2
• 3. Pharmacological Trials for the Treatment of SCI 7
• 4. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) 12
• 5. MSCs in SCI 15
• 6. Astrocytes, and Its Role in Astrogliosis and Glial Scar Formation 17
• 7. Astrocytes Phenotypes, and Related Signaling Pathways 19
• 8. Study Objectives 22
• Materials and Methods 24
• 1. Preparation of neuronal induced human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (NI-hADSCs) 24
• 2. Characterization of NI-hADSCs 24
• 3. Animals 28
• 4. SCI model and NI-hADSC transplantation 29
• 5. Functional outcome measurements 32
• 6. Tissue preparations 32
• 7. Western blot analysis 33
• 8. Immunohistochemistry 36
• 9. Lesion size quantification 36
• 10. Statistical analysis 36
• Results 38
• 1. Isolation and characterization of hADSCs 38
• 2. NI-hADSC treatment enhances functional outcomes in rats with acute SCI 46
• 3. NI-hADSC treatment decreases astrogliosis and increases the level of phosphorylation of STAT3 after SCI 51
• 4. NI-hADSC treatment reduces apoptotic cell death in peri-injury spinal cord 57
• 5. NI-hADSC treatment in the acute phase of SCI reduces astrogliosis locally, with effects limited to areas close to the treated region 61
• 6. Average lesion size was slightly, but not significantly, larger in the SCI group than in the SCI + NI group 69
• Discussion 70
• 1. Neurological Recovery after MSCs treatment in SCI 72
• A. Cell source 73
• B. Route of administration 76
• C. Treatment period 78
• D. Amount of transplanted cells 81
• 2. Modulation of astrogliosis – A1 and A2 type astrocytes 82
• 3. Suggested Mechanisms in Dual Role of Astrogliosis 85
• 4. Limitation and Future Research 89
• Conclusion 92
• References 93
• Abstract in Korean 124