Multimodal Characterization and Rational Engineering of Food-Derived Bacteria for Live Biotherapeutic Applications = 생균치료제 적용을 위한 식품 유래 균주의 멀티모달 특성 규명 및 합리적 유전체 공학 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Live biotherapeutic products (LBPs) require mechanistically defined strains that endure gastrointestinal stress and satisfy stringent safety benchmarks. This dissertation implements an integrated discovery-to-engineering pipeline that couples genome-scale characterization with targeted molecular manipulation and orthogonal phenotypic validation across three complementary probiotic platforms. Chapters are organized to align each strain with a therapeutic axis: gluten detoxification for celiac disease, antioxidant reinforcement for colitis, and γ-aminobutyric acid (GABA)–mediated modulation for metabolic disorders.
Chapter 2 evaluates a Bacillus amyloliquefaciens EG025 strain selected for robust gliadin degradation under physiologically relevant pH conditions. EG025 hydrolyzed gliadin efficiently across a broad pH range, showing near neutral optimum while retaining at least 86% of maximal activity under alkaline conditions, and after transient acid exposure its gliadin hydrolysis recovered to about 76%. In acid tolerance, the strain showed 62.5% survival after 6 hr at pH 2. In 0.5% bile it remained at 92.6% at 2 hr and 61.0% at 12 hr, which approximates the human intestinal environment, indicating transit resilience compatible with functional delivery to the small intestine. Whole genome analysis identified four probiotic function gene sets, genes linked to gliadin peptide degradation, mucosal adhesion, acid and bile resistance, and de novo vitamin biosynthesis, and high-quality whole genome assembly confirmed the absence of virulence and horizontally transferable antibiotic resistance determinants while secondary metabolite loci suggested ecological competitiveness without compromising safety. By degrading immunogenic gluten peptides before mucosal exposure, EG025 is positioned as a candidate chassis for adjunctive management of celiac disease.
Chapter 3 evaluates Lacticaseibacillus paracasei EG005 as an antioxidant probiotic candidate with potential relevance to intestinal inflammation. EG005 exhibited superior SOD-linked antioxidant activity compared with L. rhamnosus GG and maintained strong viability under gastrointestinal stress conditions. The strain sustained survival above 80% for six hours in 0.3% bile and recovered to approximately 100% viability after three hours at pH 2.5, indicating robust tolerance to gastric and intestinal environments. Phenotypic safety assessments further supported its suitability for probiotic application because EG005 showed γ-hemolysis without hemolytic activity and remained susceptible to clinically relevant antibiotics except for intrinsic kanamycin resistance. Genomic evaluation confirmed a complete and high-quality 3.07 Mb genome lacking acquired antibiotic-resistance determinants or virulence genes. Functional annotation revealed a full oxidoreduction repertoire including sodA, nox, glutathione- and thioredoxin-oxidoreduction system related genes, and three biosynthetic gene clusters which are associated with host-protective or immunomodulatory functions. Comparative structural analysis showed that the amino acid substitutions at positions 42, 113, and 114 in SOD did not alter active site geometry or the conserved folding. sodA overexpression identified the tuf promoter as the most effective for enhancing antioxidant activity, nearly doubling antioxidant activity. Together, these findings indicate that EG005 combines strong oxidative-stress mitigation capacity with high survival during gastrointestinal transit and comprehensive phenotypic and genomic safety, supporting its applicability as therapeutics with potential relevance to colitis management.
Chapter 4 develops a Levilactobacillus brevis EG040 platform with GABA hypersecretion as a therapeutic lever for metabolic disorders. Quantitative screening established EG040 as a high GABA producer, reaching 28.8 g/L, indicating that the wild type meets a production threshold suitable for genome editing. Probiotic properties were confirmed with phenotypic assays, acid tolerance showed survival of 57.9% after 3 hr in simulated gastric fluid, bile tolerance showed survival of 51% after 6 hr in 0.5% bile, and Caco-2 adhesion measured 66.5%, together indicating oral transit robustness and mucosal engagement compatible with delivery to intestinal metabolic targets. Safety assessment results confirmed γ-hemolysis only, and antibiotic susceptibility showed no acquired resistance beyond intrinsic profiles. In addition, a high completeness genome assembly revealed no acquired antibiotic resistance or virulence factors, indicating a secure genetic safety baseline as well as additional loci with potential host benefit, including polyketide synthase and lanthipeptide clusters. In CRISPR-Cas9 based genome editing results, gadR overexpression increased extracellular GABA to 49.8 g/L, about 38% compared with the wild type, and improved by 19% of survival in simulated gastric fluid relative to the EG040 wild type, indicating that transcriptional activation elevates output while strengthening acid resilience without compromising bile tolerance, adhesion, or safety. Collectively, these results support the potential of EG040 to modulate host metabolic disorders through enhanced GABA secretion.
This research leverages concurrent phenotypic assessment and genomic interrogation to close the genotype–phenotype loop and de-risk translation. Specifically, it employs whole-genome sequencing with comprehensive annotation, antiSMASH for secondary-metabolite prospecting, ABRicate-based safety screens, COG profiling, and whole-genome-based phylogenetic analysis alongside acid and bile tolerance assays, Caco-2 adhesion testing, hemolysis and antibiotic susceptibility evaluations, enzyme activity and substrate degradation assays, CRISPR-Cas9 genome editing, and RT-qPCR. This combined approach provides actionable insights into mechanism, target selection, and stability, enabling precise attribution of therapeutic traits to genetic architecture and guiding rational strain engineering.
Collectively, the dissertation demonstrates a generalizable framework for building safe, mechanism-driven probiotic chassis. By aligning EG025 with celiac disease through gluten detoxification, EG005 with colitis through antioxidant reinforcement, and EG040 with metabolic disorders through GABA secretion, the work establishes a coherent foundation for advancing live biotherapeutics toward clinical application.

국문 초록 (Abstract)

생균치료제의 임상 개발을 위해서는 기전이 명확하고 위장관 환경을 견디며, 엄격한 안전성 기준을 충족하는 균주가 필요하다. 본 연구에서는 전장유전체 수준의 치료 및 숙주의 건강 증진에 필요한 유전자들의 탐색 및 안전성 평가, 균주의 신규성 검증과 실험적인 방법을 통한 치료 표현형에 대한 활성 분석 및 안전성 검증, 치료 활성 증대를 목적으로 한 유전체 편집 등을 유기적으로 결합한 통합적 분석 및 엔지니어링 파이프라인을 제시한다.
본 연구의 각 장은 특정 질환을 목적으로 한, 잠재적 치료 효과를 갖는 프로바이오틱 균주들로 구성되며, 제 Chapter 2에서는 생리학적으로 타당한 pH 조건에서 글리아딘을 견고하게 분해하도록 선발된 Bacillus amyloliquefaciens EG025를 평가하였다. EG025는 광범위한 pH 범위에서 효율적으로 글리아딘을 가수분해하였고, 최적 활성은 중성에 근접하였으며, 알칼리성 조건에서도 최대 활성의 최소 86%를 유지하였다. 산성에 일시적으로 노출된 이후에도 글리아딘 가수분해 활성은 약 76%까지 회복되었다. 산 내성 평가에서 pH 2, 6시간 후 생존율은 62.5%였고, 0.5% 담즙에서 2시간 92.6%, 12시간 61.0%의 생존율을 보였는데, 이는 인간 소장 환경과 유사한 농도에서의 결과로서 소화관 통과 중 기능적 전달 가능성을 시사한다. 전장 유전체 분석에서는 프로바이오틱 기능과 관련된 네 가지 유전자군, 즉 글리아딘 펩타이드 분해, 점막 부착, 산과 담즙 내성 및 비타민 B1, B2, B7, B9, K2 생합성 경로에 관여하는 유전자들이 완전하게 분포되어 있는 것을 확인하였다. 고품질 유전체 어셈블리는 독성 인자와 수평 전이를 통한 항생제 내성 유전자의 부재를 확인하였고, 이차대사 산물 관련 좌위는 안전성을 훼손하지 않으면서 생태학적 경쟁력을 시사하였다. 이러한 특성들을 종합하여 고려하였을 때, EG025는 점막 노출 이전에 면역원성 글루텐 펩타이드를 신속히 분해하고 숙주의 건강 기능에도 이로운 효과를 제공할 수 있는 셀리악병의 생균치료제로서 충분한 잠재성을 갖는 것으로 추론할 수 있다.
제 3장에서는 항산화 강화 전략을 통해 장내 염증을 완화하기 위한 플랫폼으로 Lacticaseibacillus paracasei EG005를 조사하였다. 항산화 활성 스크리닝에서 EG005는 양성 대조군인 LGG보다 높은 Superoxide dismutase (SOD) 활성을 보여, 점막 염증을 유발하는 내강 산화 스트레스를 저감할 내재적 잠재력을 나타냈다. 고품질의 전장유전체를 이용한 유전체 분석 결과에서는, 유전체 내에서의 획득성 항생제 내성과 독성 인자의 부재를 확인하였고, 표현형적인 안전성 평가에서는 γ-용혈 활성만 관찰되었으며, 내재적인 항생제 내성을 제외한 항생제 감수성이 관찰되어 전임상 개발의 안전성 기반을 뒷받침하였다. 모의 소화액에 대한 내산성 결과에서는 pH 2.5, 3시간 후 생존율은 약 100%로 회복되었고, 0.3% 담즙에서 6시간 동안 생존율은 80% 이상으로 유지되어 경구 전달에 적합한 안정성을 보였다. 또한 프로바이오틱 기능과 관련하여 두 개의 RiPP 생합성 유전자 클러스터 및 Terpenoid 생합성과 관련된 유전자 클러스터가 존재하는 것을 확인할 수 있었고, SOD 단백질의 다중 서열 비교 분석 및 3차원 구조 예측 결과에서는 대표적인 프로바이오틱 스트레인과의 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 마지막으로 항산화 효과를 강화하기 위하여 과발현용 프로모터를 사용한 유전자 변형을 가한 결과, tuf 프로모터를 사용하여 sodA 유전자를 과발현시킨 EG005 돌연변이의 경우, 야생형 균주와 비교하여 약 2배 증가된 항산화 활성을 보였으며, 산과 담즙 내성의 손상 없이 항산화 기전을 강화함으로써 대장염 치료를 위한 생균치료제로서의 잠재성을 확인할 수 있었다.
제 4장에서는 비만, 고혈압, 당뇨를 동반하는 대사성 질환의 치료를 위한 생균치료제 후보 균주로서γ-아미노부티르산(GABA) 과분비를 중심으로 Levilactobacillus brevis EG040 플랫폼을 개발하였다. 정량 분석 기반의 GABA 분비능 스크리닝에서 EG040은 28.8 g/L의 GABA 생산량을 보여, 유전자 편집에 적합한 섀시로서의 생산성 기준을 충족하였다. 표현형적인 프로바이오틱 특성을 조사하기 위한 연구에서는, EG040은 모의 소화액에서 3시간 후 57.9%의 생존율을 보였고, 0.5% 담즙에서 6시간 후 51%의 생존율을 보였으며, Caco-2 부착률은 66.5%로 확인되었다. 이러한 결과들은 EG040의 장내 대사 표적에 대한 경구 전달 견고성과 점막 상호작용 가능성을 함께 시사하였다. 안전성 평가에서 표현형으로는 γ-용혈만 관찰되었고, 항생제 감수성 검사 결과에서는 내재적인 항생제 내성을 제외하고 획득성 내성이 확인되지 않았다. 또한 고완성도의 전장유전체 분석에서는 EG040의 유전체 내 획득성 항생제 내성과 독성 인자의 부재를 확인하였으며, Polyketide 생합성 유전자 클러스터와 Lanthipeptide 생합성 유전자 클러스터를 포함한 숙주의 건강 증진에 관련된 생합성 좌위를 추가로 제시하여 기능유전적 기반을 강화하였다. CRISPR-Cas9 기반 유전체 편집 결과에서는 gadR 유전자의 과발현이 GABA분비능을 49.8 g/L까지 증가시켜 야생형 대비 약 38% 향상시켰고, 모의 위액에서의 생존율 또한 EG040 야생형 대비 19%가 개선되어, 전사 활성화를 통한 산 저항성 강화와 생산성 증대가 담즙 내성, 부착, 안전성의 손상 없이 병행될 수 있음을 보여주었다. 종합하면, 이러한 결과는 EG040이 강화된 GABA 분비를 통해 숙주의 대사성 지표를 조절할 잠재력을 지님을 시사하였다.
본 연구는 표현형 평가와 유전체 분석을 통합적으로 활용하여 유전형-표현형 연계를 완결하고 전임상 전환의 불확실성을 낮춘다. 구체적으로, 전장유전체 서열분석, antiSMAS를 통한 2차 대사 산물 탐색, ABRicate 기반의 안전성 평가, COG 프로파일링, 전장유전체 계통 분석을 수행하였으며, 내산 및 내담즙성 시험, Caco-2 대장 세포 부착 평가, 용혈 및 항생제 감수성 시험, 각 스트레인의 치료 활성 시험, CRISPR-Cas9 기반의 유전체 편집 등을 병행하였다. 이와 같은 통합적인 접근은 기전, 표적 선정, 안정성에 관한 실행 가능한 인사이트를 제공함으로써, 치료 형질을 유전 구조와 정밀하게 접목시키고 합리적인 생균치료제 설계 근거를 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Contents
• ABSTRACT I
• CONTENTS VI
• LIST OF TABLES IX
• LIST OF FIGURES XI
• CHAPTER 1. GENERAL INTRODUCTION 1
• 1. Background 2
• 1.1. Probiotics 2
• 1.2. Live biotherapeutic products (LBPs) 3
• 1.3. Differences between probiotics and LBPs 4
• 1.4. GRAS bacteria 6
• 1.5. Fermented foods as sources for isolating probiotics and LBPs 6
• 1.6. Rational engineering 8
• 2. Literature review 10
• 2.1. Representative probiotic strains with human evidence and translational considerations 10
• 2.2. Current research and industrial trends of LBPs 11
• 2.3. Domestic GRAS strains with mechanistic leads and fermented foods as isolation sources 14
• 2.4. Safety assessment standards for probiotics and LBPs 15
• 2.5. Limitations of traditional assays and the case for an integrative experimental–genomic approach 18
• 3. Research objective 20
• CHAPTER 2. GENOMIC AND PHENOTYPIC EVALUATION OF THE GLIADIN DEGRADING PROBIOTIC BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS EG025 FROM CHEONGGUKJANG FOR CELIAC DISEASE TREATMENT 23
• 1. Abstract 24
• 2. Introduction 26
• 3. Material and methods 36
• 4. Results 49
• 5. Discussion 118
• CHAPTER 3. INTEGRATIVE PHENOTYPIC AND GENOMIC ANALYSIS OF LACTICASEIBACILLUS PARACASEI EG005 FOR PROBIOTIC FUNCTION EVALUATION AND ENHANCED ANTIOXIDANT ACTIVITY TOWARD COLITIS THERAPEUTIC POTENTIAL 128
• 1. Abstract 129
• 2. Introduction 131
• 3. Materials and methods 140
• 4. Results 156
• 5. Discussion 187
• CHAPTER 4. PROBIOTIC POTENTIAL OF LEVILACTOBACILLUS BREVIS EG040 ISOLATED FROM DONGCHIMI AND CRISPR-CAS9 BASED GENOME EDITING FOR ENHANCED Γ-AMINOBUTYRIC ACID SECRETION 198
• 1. Abstract 199
• 2. Introduction 201
• 3. Materials and Methods 212
• 4. Results 234
• 5. Discussion 264
• REFERENCES 277
• 국문초록 319 
• List of Tables
• Table 1. Phenotypic antibiotic resistance result for EG025 measured by Kirby-Bauer disc diffusion test using frequently prescribed antibiotics. 60
• Table 2. Comparison of detected genes related with antibiotic resistance and virulence factor between B. amyloliquefaciens EG025, LFB112, and TL106 using ABRicate across various databases. 63
• Table 3. Detected antibiotic resistance genes and virulence factors in Bacillus amyloliquefaciens EG025, LFB112, and TL106 64
• Table 4. Putative genes involved in gliadin degradation detected in B. amyloliquefaciens EG025 genome. 77
• Table 5. Putative genes involved in acid and bile salt tolerance detected in B. amyloliquefaciens EG025 genome 80
• Table 6. Putative genes involved in stress response detected in B. amyloliquefaciens EG025 genome. 86
• Table 7. Putative genes involved in adhesion and aggregation detected in B. amyloliquefaciens EG025 genome. 90
• Table 8. Primers used in this study for construction and amplification. 151
• Table 9. Plasmids used in this study. 152
• Table 10. Minimum inhibitory concentration (MIC) results for EG005 for various antibiotics 164
• Table 11. Comparison of detected genes between EG005 and S. aureus MRSA252 using ABRicate across various databases. 166
• Table 12. Detected genes related with oxidoreduction system in L. paracasei EG005 172
• Table 13. List of primers used in this study. 225
• Table 14. List of plasmids which used in this study. 227
• Table 15. List of primers which used in RT-qPCR experiment. 232
• Table 16. Phenotypic antibiotic resistance result measured by Kirby-Bauer disc diffusion test using various antibiotics. 244
• Table 17. Comparison of detected gene counts between L. brevis EG040 and Salmonella enterica S8 using ABRicate across various databases. 250
• List of Figures
• Figure 1. Screening of probiotic candidates based on colony morphology and gliadin–halo formation. 50
• Figure 2. Effect of pH on the gliadin-degrading activity of B. amyloliquefaciens EG025 53
• Figure 3. Acid and bile tolerance profiles of B. amyloliquefaciens EG025 56
• Figure 4. Hemolytic activity assessment of B. amyloliquefaciens EG025 58
• Figure 5. Genomic characteristics of B. amyloliquefaciens EG025 70
• Figure 6. Comparative analysis of COG classifications among B. amyloliquefaciens strains 74
• Figure 7. Thiamine (vitamin B1) biosynthesis pathway and detected genes in Bacillus amyloliquefaciens EG025 95
• Figure 8. Riboflavin (vitamin B2) biosynthesis pathway and detected genes in B. amyloliquefaciens EG025 98
• Figure 9. Biosynthetic pathway and gene identification for vitamin B7 (biotin) in B. amyloliquefaciens EG025 101
• Figure 10. Biosynthetic pathway and gene identification for vitamin B9 (folate) in B. amyloliquefaciens EG025 103
• Figure 11. Biosynthetic pathway and gene identification for vitamin K2 (menaquinone) in B. amyloliquefaciens EG025 107
• Figure 12. Secondary metabolite biosynthetic gene clusters in B. amyloliquefaciens EG025 110
• Figure 13. Representative secondary metabolite biosynthetic gene clusters identified in the genome of B. amyloliquefaciens EG025 113
• Figure 14. Phylogenetic analyses evaluating genetic relatedness among B. amyloliquefaciens strains 116
• Figure 15. Antioxidant activity screening result of LAB isolates 157
• Figure 16. Antioxidant activity comparison and pH effect on antioxidant activity of EG005 158
• Figure 17. Acid and bile tolerance assessment result for EG005 and LGG 160
• Figure 18. Hemolytic activity of S. aureus and L. paracasei EG005 162
• Figure 19. Genomic architecture and COG-based functional classification of L. paracasei EG005 169
• Figure 20. Comparative structural analysis of SOD proteins from L. paracasei EG005 and probiotic strains 175
• Figure 21. Biosynthetic gene clusters identified in L. paracasei EG005 179
• Figure 22. Whole genome-based phylogenetic analysis of L. paracasei EG005 182
• Figure 23. sodA overexpression plasmids and antioxidant activity comparison among recombinant L. paracasei EG005 strains 185
• Figure 24. Colony morphology, 16S rRNA sequencing results, and GABA secretion screening results for LABs isolated from various types of kimchi 236
• Figure 25. Probiotic properties of L. brevis EG040 and the effect of CRISPR-Cas9–based genome editing 240
• Figure 26. Hemolytic activity test result for safety assessment of L. brevis EG040 243
• Figure 27. Genomic features of L. brevis EG040 as analyzed using the GenoVi program 246
• Figure 28. Secondary metabolite biosynthetic gene clusters in the genome of L. brevis EG040 248
• Figure 29. Phylogenetic analysis based on the whole genome sequence of L. brevis EG040 252
• Figure 30. PCR results for the confirmation of genotype involving norG deletion and gadR overexpression 254
• Figure 31. Sequencing results of the PCR product confirming the genotype of norG deletion and slpA promoter replacement 255
• Figure 32. RT-qPCR analysis of GABA biosynthetic gene cluster expression in L. brevis EG040, EG040::ΔnorG, and EG040::PslpA-gadR during different growth phases 258
• Figure 33. Impact of CRISPR-Cas9–mediated genome editing on GABA secretion and growth curves 262