Multi-factor mRNA coding sequence optimization for enhanced RNA stability and protein expression = mRNA 약물의 안정성 및 발현량 증진을 위한 다중 요소 기반 코딩 서열 최적화

국문 초록 (Abstract)

mRNA 약물은 백신 및 치료제 개발을 위한 유망한
플랫폼으로 부상하고 있다. 그러나 RNA 분자의 불안정성과
과도한 선천성면역 활성화와 같은 핵심적인 한계를 극복하기
위해서는 추가적인 코딩 서열 최적화가 필요하다. 따라서,
효과적인 mRNA 약물을 위한 코딩 서열 설계는 RNA 안정성을
높여 세포 내에서 mRNA 분자의 기능적 반감기를 연장하며,
과도한 선천성면역 인식을 피하는 것을 목표로 한다. 기존의 코딩
서열(coding sequence, CDS) 최적화 알고리즘은 주로 최소
자유에너지(minimum free energy, MFE)와 코돈 적응 지수(codon
adaptation index, CAI)와 같이 제한된 소수의 지표에 집중하거나,
사용자가 최적화 목표를 유연하게 추가 및 변경하기 어렵다는
한계를 가진다. 따라서, 본 연구에서는 모듈형 점수 구조를 통해
다양한 최적화 목표를 유연하게 조합할 수 있는 기존의 CDS
최적화 도구인 VaxPress를 활용하였다.
먼저 VaxPress에 볼츠만 분포에 기반한 앙상블 구조 안정성
지표인 average unpaired probability (AUP) 모듈을 통합하였다. 이를
통해 대부분의 기존 도구가 단일 MFE 구조만을 기준으로 2차
구조를 평가하던 한계를 보완하였다. In silico 비교 결과, AUP를
최소화하도록 최적화된 설계는 MFE 기반 최적화에 비해 전체
구조 앙상블에서 결합을 이루지 않는 염기의 총 개수를 더
효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 다양한 최적화 목표를 실험적으로 검증하기 위해, VaxPress를
사용하여 18종의 나노루시퍼레이스 CDS를 설계하고, 8종의
벤치마크 서열과 함께 HCT116 세포에서 비수정 uridine 및 N1-
methylpseudouridine (m1Ψ) 치환 mRNA를 각각 사용하여 24시간
시점의 단백질 활성을 측정하였다. 다중선형회귀와 랜덤 포레스트
기반의 다변량 모형 분석 결과, 비수정 U 및 m1Ψ 조건 모두에서
CDS의 U 개수가 단백질 발현에 일관된 음의 영향을 주는 주요
예측 변수로 나타났다. 그러나 제한된 데이터 수로 인해 전체적인
예측 성능과 모형의 견고성은 부족하였다.
한편, m1Ψ 조건에서는 구조 관련 지표(AUP, MFE, DegScore)가
단백질 발현과 양의 상관관계를 보여, 비수정 U 조건에서 관찰된
경향과 반대되는 결과가 나타났다. 이는 m1Ψ 도입이 mRNA 2차
구조가 코딩 서열 최적성에 미치는 영향을 변화시켜, m1Ψ
조건에서의 변화된 번역 맥락으로 인한 높은 리보솜 밀도에서는
강한 2차 구조가 오히려 번역 의존적 mRNA 분해를 촉진할 수
있음을 시사한다. 또한 개시 코돈 인근 2차 구조의 강도만을
달리하도록 설계한 비교 서열 쌍들에서는, U 및 m1Ψ 조건
모두에서 24시간 단백질 발현량의 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
종합하면, 본 연구는 VaxPress에 AUP 모듈을 도입함으로써
CDS 2차 구조 최적화 전략을 MFE 기반 단일 구조 평가에서
앙상블 기반 평가로 확장하였고, 다양한 CDS 특성과 단백질 발현
간 상호작용을 정량적으로 분석한 실험 데이터를 제공한다.
시뮬레이션 기반 분석 결과, 안정적인 예측 모형을 구축하기
위해서는 약 100–150종 규모의 CDS 라이브러리가 필요할 것으로
추정되며, 이는 향후 대규모 mRNA 최적화 및 검증 실험의 설계
기준을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

mRNA drugs have emerged as a promising platform for vaccines and therapeutics. However, further optimization is needed to overcome key challenges, such as the inherent instability of RNA molecules and the induction of innate immunogenicity. Rational mRNA design seeks to extend the cellular functional half-life of the mRNA molecule by reducing chemical, enzymatic, and translation-dependent mRNA decay. Existing coding sequence (CDS) optimization algorithms (e.g., LinearDesign) often focus on a limited set of features, such as minimum free energy (MFE) and codon adaptation index (CAI), and lack the flexibility for users to add or modify objectives. This study utilizes the VaxPress package, whose modular scoring architecture enables flexible adjustment of optimization objectives.
To enhance VaxPress, I integrated the average unpaired probability (AUP) module, an ensemble-based stability metric derived from the Boltzmann distribution. This integration overcomes the limitation of most current tools that rely solely on MFE for secondary structure optimization. In in silico comparisons, AUP-optimized designs were more effective at reducing the total number of unpaired bases across the structure ensemble compared to MFE-optimized designs.
To experimentally validate various optimization goals, I designed 18 nanoluciferase CDSs using VaxPress and measured 24 h functional protein levels in HCT116 cells using unmodified uridine or N1-methylpseudouridine (m1Ψ)-incorporated mRNAs, along with 8 benchmark sequences. Multivariate modeling by multiple linear regression and random forest identified uridine count as the most consistently dominant predictor, showing a negative correlation with protein expression under both unmodified U and m1Ψ conditions. However, the overall predictive performance and robustness of the models were limited by the small sample size.
A key unexpected finding was observed under m1Ψ conditions, where structure-related metrics (AUP, MFE, DegScore) were positively correlated with protein expression, opposite to the trend seen under unmodified U conditions. This suggests that m1Ψ incorporation may alter the impact of RNA structure on CDS optimality, potentially leading strong secondary structures to enhance translation-dependent mRNA decay in a high ribosome density regime. Furthermore, comparison pairs designed to modulate start codon-proximal secondary structure showed no statistically significant difference in 24 h protein expression under either U or m1Ψ conditions.
In conclusion, this work extends rational CDS design strategies by incorporating the AUP module into VaxPress and provides quantitative experimental data on the interplay between diverse CDS features and protein expression. Simulation studies indicated that a library on the order of 100– 150 CDS variants is necessary to build reasonably stable predictive models.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Contents iv
• List of Figures vi
• List of Tables vii
• List of Abbreviations viii
• 1. Introduction １
• 1.1. mRNA drug platform for vaccine and therapeutics １
• 1.2 Codon usage optimization in heterologous gene expression ３
• 1.3 Computational methods for CDS design in mRNA drugs ５
• 1.4 VaxPress: a framework for multi-objective CDS optimization ７
• 2. Evaluating mRNA structure based on Boltzmann ensemble １０
• 2.1 Background １０
• 2.2 Implementing BPP-based stability metric in VaxPress １１
• 2.3 Discussion １８
• 3. Experimental validation of CDS optimization strategies using a nanoluciferase reporter １９
• 3.1 Background １９
• 3.2 Materials and Methods ２０
• 3.3 Nanoluciferase reporter mRNA construct ２４
• 3.4 Design of VaxPress-optimized nanoluciferase CDSs ２９
• 3.5 Effect of start-codon-proximal structure on protein expression ３７
• 3.6 Expression and sequence-feature relationships under unmodified U conditions ４１
• 3.7 Expression and sequence-feature relationships under m1Ψ conditions ４５
• 3.8 Modeling the combined effects of CDS features under U and m1Ψ conditions ５１
• 3.9 Discussion ５６
• 4. Conclusion ６６
• Bibliography ６８