Molecular characterization of two effector genes, MoHTR17 and MoIEC1, in the rice blast fungus, Magnaporthe oryzae = 벼 도열병균의 두 이펙터 유전자 MoHTR17 및 MoIEC1의 분자적 특성 규명

국문 초록 (Abstract)

식물 병원성 곰팡이는 기주의 면역 체계를 무력화하고 성공적인 정착을 달성하기 위해 다양한 이펙터 단백질을 이용한다. 이러한 이펙터들은 기주 조직 내에서의 공간적 위치와 작용 부위에 따라 세포 외 기질에서 작용하는 아포플라스트 (apoplastic) 이펙터, 기주 세포질로 이동하는 세포질 (cytoplasmic) 이펙터, 그리고 기주의 핵을 표적으로 하여 전사 프로그램을 직접 조절하는 핵 (nuclear) 이펙터로 분류된다. 벼 도열병균인 Magnaporthe oryzae에서 수많은 이펙터가 동정되었음에도 불구하고, 감염 단계 특이적인 발현 조절 기전과 개별 이펙터들의 기능적 역할에 대해서는 여전히 이해가 부족하다. 본 연구에서는 기주 감염 동안 특이적으로 발현이 유도되는 두 이펙터 후보인 MoHTR17과 MoIEC1의 특성을 분석하였다. MoHTR17은 DNA 결합 도메인이 예측되는 MoHTR (M. oryzae Host Transcription Reprogramming) 패밀리에 속하며, MoIEC1은 프로모터에 보존된 IPA (in planta active) 엘리먼트를 보유한 이펙터 후보이다. MoHTR17과 MoIEC1은 모두 감염 특이적으로 전사가 유도되며, 기주 침입 과정 동안 생물영양 계면 복합체 (biotrophic interfacial complex, BIC)에 특이적으로 축적됨을 확인하였다. 유전자 결실 변이체를 이용한 기능 분석을 통해 두 유전자가 균의 완전한 병원성 유지에 필수적임을 입증하였다. 나아가, IPA 엘리먼트가 MoIEC1의 기주 내 특이적 발현에 결정적인 역할을 수행하며, 특히 이 과정이 기존에 IPA 엘리먼트에 결합하는 것으로 알려진 전사 조절 인자인 RGS1에 의해 시기적, 단계적으로 조절됨을 증명하였다. 본 연구 결과는 MoHTR17을 통해 MoHTR 패밀리의 기능적 다양성을 제시함과 동시에, 벼-도열병균 상호작용 시 이펙터 발현의 시기적 조절을 위한 핵심 조절 노드로서 IPA 엘리먼트의 중요성을 뒷받침함으로써 벼 도열병균의 이펙터 레퍼토리와 병원성 조절 네트워크에 대한 심도 있는 이해를 제공한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Plant pathogenic fungi utilize a diverse array of effector proteins to neutralize host immune systems and facilitate successful colonization. Based on their spatial localization and site of action within host tissues, these fungal effectors are broadly classified into three groups: apoplastic effectors, which function in the extracellular matrix; cytoplasmic effectors, which are translocated into the host cytosol; and nuclear effectors, which target the host nucleus to directly modulate transcriptional programs. Although numerous effectors have been identified in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae, the molecular mechanisms governing their infection stage-specific expression and functional roles remain insufficiently understood. In this study, two effector candidates, MoHTR17 and MoIEC1, were characterized, both whose expression is specifically induced during host infection. MoHTR17 is a member of the MoHTR (M. oryzae Host Transcription Reprogramming) family with a predicted DNA-binding domain, while MoIEC1 was identified as an effector candidate harboring a conserved in planta active (IPA) element in its promoter. Both MoHTR17 and MoIEC1 exhibited robust infection-specific transcriptional induction and were found to specifically accumulate at the biotrophic interfacial complex (BIC) during host invasion. Functional analyses using targeted deletion mutants demonstrated that both MoHTR17 and MoIEC1 are critical for full fungal pathogenicity. Furthermore, the IPA element was shown to be crucial for the in planta-specific expression of MoIEC1. Specifically, the expression of MoIEC1 is regulated by RGS1, a transcriptional regulator previously known to bind the IPA element. These findings broaden the knowledge of the M. oryzae effector repertoire—highlighting the functional diversity of the MoHTR family through MoHTR17—and further support the significance of the IPA element as a key regulatory node for the temporal coordination of effector expression during the rice–M. oryzae interaction.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT i
• CONTENTS iii
• LIST OF TABLES v
• LIST OF FIGURES vi
• INTRODUCTION 1
• MATERIALS & METHODS 5
• I. Fungal genomic DNA extraction 5
• II. Fungal protoplast preparation 5
• III. Generation of gene deletion and complementation strains 6
• IV. Southern blot analysis 8
• V. RNA extraction and qRT-PCR 8
• VI. Quantitative analysis of MoHTR17 and MoIEC1 expression by qRT-PCR 10
• VII. Visualization of MoHTR17 and MoIEC1 promoter activity using sGFP reporters 11
• VIII. Construction of effector localization reporter strains and in planta fluorescence microscopy 12
• IX. Phenotype assays 13
• X. Pathogenicity assays 14
• XI. Functional analysis of the IPA element in the MoIEC1 promoter 15
• RESULTS 19
• I. MoHTR17 and MoIEC1 are specifically up-regulated during host infection 19
• II. MoHTR17 and MoIEC1 localize to the biotrophic interfacial complex during host infection 24
• III. MoHTR17 and MoIEC1 are dispensable for vegetative growth and developmental phenotypes 27
• IV. MoHTR17 and MoIEC1 are required for pathogenicity of M. oryzae 32
• V. The IPA element is required for in planta-specific expression of MoIEC1 36
• VI. The IPA element-dependent expression of MoIEC1 is regulated by RGS1 39
• DISCUSSION 41
• LITERATURE CITED 46
• ABSTRACT IN KOREAN 53