Molecular basis for selective blockade of Tentonin 3/TMEM150C, a mechanosensitive channel by conotoxin-derived peptides = 코노톡신 유래 펩타이드에 의한 기계채널 텐토닌3의 선택적 차단에 대한 분자 기전 연구

국문 초록 (Abstract)

Tentonin 3 (TTN3/TMEM150C)는 기계적 자극에 반응하는 기계감지 이온 채널로서, 느리게 비활성화되는 특이적 전류 특성을 지니며, 고유감각, 혈압 조절, 인슐린 분비 등 다양한 생리적 기능에서 중요한 역할을 수행한다. 구조 예측 알고리즘(AlphaFold2)에 따르면, TTN3는 네 개의 소단위체로 이루어진 사량체 구조를 형성하며, 중심부에 이온 전도를 위한 기공을 갖추고 있고, 기공 입구에는 음전하를 띠는 아미노산 고리가 존재하여 양이온 선택성과 관문 기능에 기여하는 것으로 예상된다. 그러나 현재까지 TTN3의 선택적인 억제제는 보고되지 않았으며, 이 채널의 분자 수준에서의 작용 기전은 충분히 규명되지 않았다.
본 연구에서는 코노톡신 계열 펩타이드인 ρ-TIA 및 그 유도체인 NMB-1이 TTN3를 선택적으로 억제할 수 있는지를 전기생리학적 방법으로 평가하였다. TTN3를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 기계적 자극을 가한 후 유입 전류를 측정한 결과, NMB-1은 TTN3 유도 전류를 강하게 억제한 반면, ρ-TIA는 비교적 약한 억제 효과만을 나타냈다. 두 펩타이드는 모두 Piezo1에는 억제 효과를 나타내지 않아, TTN3에 대한 선택성이 확인되었다. 이어진 알라닌 스캐닝 돌연변이 실험을 통해 NMB-1의 Lys16, Arg4와 같은 양전하 잔기가 억제 기능에 필수적임을 확인하였으며, TTN3의 Glu126 역시 억제에 관여하는 핵심 잔기로 작용함을 확인하였다. 특히, TTN3의 Glu126을 알라닌 또는 글루타민으로 치환했을 때 NMB-1의 억제 효과가 유의미하게 감소하였다. 또한, 분자동역학(MD) 시뮬레이션을 통해 NMB-1의 Lys16이 TTN3의 Glu126과의 지속적인 전기적 상호작용을 통해 채널 입구에 고정되는 양상을 관찰할 수 있었고, 이는 억제 메커니즘이 정전기적 상보성에 기초함을 시사한다.
본 연구는 NMB-1이 TTN3를 선택적으로 억제하는 새로운 기전을 밝힘으로써, TTN3의 기능적 분석을 위한 분자 탐침으로서의 활용 가능성을 제시하고, 기계감지 채널에 대한 특이적 조절 분자의 개발 가능성을 보여준다. 특히, 기계적 민감성에 의한 통증, 대사 조절 이상, 신경질환 등과 연관된 TTN3의 병태생리적 역할에 대한 심층 연구와 함께, 본 연구 결과는 TTN3를 표적으로 하는 치료제 개발에 있어 중요한 기초자료가 될 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Tentonin 3 (TTN3/TMEM150C) is a mechanosensitive ion channel that responds to mechanical stimuli and exhibits distinct slow inactivation kinetics. It plays critical roles in mechanotransduction processes such as proprioception, blood pressure regulation, and insulin secretion. Structurally, TTN3 forms a tetramer with a predicted architecture and a central pore. The conotoxin ρ-TIA and its synthetic analog, noxious mechanosensation blocker 1 (NMB-1), were originally developed to inhibit slowly adapting mechanically activated (MA) currents in dorsal root ganglion (DRG) neurons. As TTN3 mediates slowly adapting MA currents in DRG neurons, both NMB-1 and ρ-TIA were hypothesized to inhibit TTN3 activity. Indeed, NMB-1 robustly inhibited TTN3, whereas ρ-TIA exhibited only a weak effect; neither peptide affected Piezo1. Alanine-scanning mutagenesis combined with electrophysiological assays revealed that positively charged residues in NMB-1 are essential for its inhibitory function. Additionally, a glutamate residue (Glu126) near the TTN3 pore entrance was identified as critical for NMB-1-mediated inhibition, suggesting a key electrostatic interaction between NMB-1 and TTN3. Molecular dynamics simulations further support this electrostatic interaction between the peptide ligand and the channel protein. These findings provide mechanistic insight into the selective inhibition of TTN3 by NMB-1 and provide a foundation for developing therapeutic agents targeting TTN3-related channelopathies

목차 (Table of Contents)

• Abstract ⅰ
• Table of Contents ⅲ
• List of Figures ⅵ
• Introduction 1
• 1. Ion Channels 1
• 2. Mechanosensitive ion channels (MSCs) 4
• 2.1 MscL/MscS 7
• 2.2 OSCA/TMEM63 10
• 2.3 K2P channels 11
• 2.4 TMC1/2 channels 12
• 2.5 PIEZO channels 14
• 2.6 Force from lipid 16
• 2.7 Force from filament 17
• 3. Tentonin 3/TMEM150C (TTN3) 22
• 3.1 Overview 22
• 3.2 Structure of TTN3 23
• 3.3 Physiological roles of TTN3 24
• 3.4 Inhibition of Tentonin3 by noxious mechanosensation blocker 1 (NMB-1) 25
• 4. Peptide toxins 26
• 4.1 Conotoxins 26
• 4.2 ρ-TIA 28
• 4.3 Noxious Mechanosensation Blocker 1 29
• Purpose of the study 31
• Methods 32
• 1. Cell culture and transfection 32
• 2. Site-direted mutagenesis 32
• 3. NMR experiments 33
• 4. NMB-1 modeling 33
• 5. Recording MA currents 34
• 6. Mechanical stimulation 35
• 7. Molecular dynamics simulation 35
• 8. Statistical analysis 36
• Results 37
• 1. Inhibition of TTN3 by NMB-1 37
• 1.1 Selective inhibition of TTN3 37
• 1.2 Pharmacological properties of NMB-1 on TTN3 40
• 2. Structural characterization of NMB-1 42
• 2.1 NMR spectroscopy of NMB-1 42
• 2.2 NMB-1 modeling using RosettaCM 45
• 3. Inhibitory mechanism of NMB-1 on TTN3 49
• 3.1 Key residues in NMB-1 for TTN3 inhibition 49
• 3.2 NMB-1 acting site in TTN3 53
• 4. Inhibition of TTN3 by ρ-TIA 56
• 4.1 Inhibition effects of ρ-TIA 56
• 4.2 Key residues in ρ-TIA for TTN3 inhibition 60
• 5. Electrostatic mechanism of TTN3-NMB-1 binding 62
• 6. Gd3+ and ruthenium red block TTN3 via different mechanism from NMB-1 64
• 7. MD simulations of TTN3-NMB-1 binding 66
• Discussion 71
• References 76
• 국문 초록 95