Integrated analysis of subclinical endometritis, uterine microbiota, and reproductive performance in dairy heifers = 젖소 육성우에서 준임상형 자궁내막염, 자궁 내 미생물 균총 및 번식 효율 간의 통합적 연관성 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Subclinical endometritis, typically defined by elevated endometrial polymorphonuclear neutrophils (PMN) in the absence of clinical abnormalities, is a well-established cause of reduced fertility in postpartum cows. However, little is known about whether comparable subclinical inflammatory processes occur in pre-breeding heifers, which have not yet undergone calving-associated tissue remodeling or experienced the metabolic and microbial perturbations of lactation. As postpartum diagnostic criteria may not be appropriate for heifers, this study aimed to identify preliminary, heifer-specific indicators of early uterine inflammation by integrating cytological, immunological, microbial, hematological, and reproductive measurements within a unified analytical framework.
Eight healthy Holstein heifers were sampled seven days prior to embryo transfer. Endometrial cytology revealed a continuous range of PMN values from zero to 15%. Retrospective evaluation demonstrated that a threshold near 5% was most informative for predicting fertility outcomes. Among heifers with PMN below 5%, three of four conceived successfully, whereas none with PMN at or above this level maintained pregnancy. Although sample size limited statistical power, logistic modeling and contingency analysis supported a consistent negative association between PMN% and conception probability. Serum cytokine measurements showed that IL-6 concentrations increased in parallel with PMN values, indicating localized immune activation even in the absence of detectable IL-1β or TNF-α.
Uterine microbiota analysis revealed marked ecological differences between low and high PMN groups. Heifers with elevated PMN%s demonstrated substantially reduced alpha-diversity and significant beta-diversity separation, reflecting early disruption of microbial stability. Differential abundance analyses conducted through ANCOM-BC, LEfSe, and MaAsLin2 consistently identified Oscillospiraceae_NK4A214_group as an inflammation-sensitive genus. Additional genera enriched in low PMN heifers, including Oscillospiraceae_UCG-005, Rikenellaceae_RC9_gut_group, Monoglobus, Mailhella, Parasutterella, and Alistipes, are associated in ruminant systems with short-chain fatty acid production and mucosal homeostasis. Their reduced abundance in higher PMN animals suggests a functional loss of barrier stabilizing and immune modulating microbial groups during early inflammatory progression.
In addition to inflammation-associated taxa, MaAsLin2 identified several genera specifically enriched in heifers that successfully conceived, including Faecalibacterium, Prevotella_7, Parabacteroides, Luteimonas, Methylorubrum, Aerococcus, and Enhydrobacter. These pregnancy-associated genera were not linked to PMN-related inflammation, suggesting that uterine receptivity may be influenced by microbial features independent of cytological status.
Complete blood count parameters generally remained within physiological intervals, indicating that early uterine inflammation in heifers may remain localized and is not necessarily accompanied by systemic hematologic alterations. Nevertheless, mild inter-individual variability suggested that CBC provides supportive contextual information when interpreted alongside PMN%, cytokine levels, and microbiota composition.
Taken together, these results demonstrate that modest increases in endometrial PMN%, concurrent elevations in IL-6, early loss of short-chain fatty acid associated genera, and reduced conception success are closely interconnected in pre-breeding Holstein heifers. A preliminary PMN threshold of 5% appears biologically meaningful in identifying early uterine inflammation that compromises embryo receptivity. Integrating cytological, immunological, and microbial biomarkers provides a heifer-specific diagnostic framework that may enhance early detection of reproductive risk and guide more effective embryo transfer management strategies within dairy production systems.

국문 초록 (Abstract)

준임상형 자궁내막염(subclinical endometritis)은 임상 증상 없이 자궁내 다형핵중성구(PMN)가 증가하는 상태로, 분만 후 젖소에서 번식 효율 저하의 주요 원인으로 잘 알려져 있다. 그러나 분만 경험이 없고 산유나 대사 스트레스를 겪지 않은 육성우에서는 이와 유사한 염증 과정이 존재하는지 명확히 규명된 바가 없다. 경산우에 기반한 기존 진단 기준을 육성우에 동일하게 적용하기 어렵다는 점에서, 본 연구는 세포학적, 면역학적, 미생물학적, 혈액학적, 번식학적 지표를 통합하여 육성우 단계에서 적용 가능한 초기 자궁 염증 지표를 탐색하는 것을 목표로 하였다.
총 8두의 건강한 홀스타인 육성우를 대상으로 수정란 이식 7일 전에 자궁내막 샘플을 수집하였다. 자궁내막 세포학 평가 결과 PMN 비율은 0%에서 15%까지 연속적으로 분포하였다. 후향적 분석에서 약 5% 수준이 번식 성공을 가장 명확히 구분하는 임계값으로 나타났으며, PMN이 5% 미만인 개체에서는 4두 중 3두에서 임신이 유지된 반면 PMN이 5% 이상인 개체에서는 임신 성공이 한 건도 관찰되지 않았다. 표본 수의 한계에도 불구하고 로지스틱 회귀와 분할 표 분석에서 PMN 증가와 수태 성공률 감소 간의 일관된 음의 연관성이 확인되었다. 혈청 사이토카인 분석에서는 IL-6 농도가 PMN 증가와 평행하게 상승하였으며 IL-1β와 TNF-α는 검출되지 않아 국소적이고 만성적인 저등급 염증을 시사하였다.
자궁내 미생물 분석에서는 PMN이 높은 개체에서 알파 다양성 감소와 베타 다양성의 유의한 분리 현상이 관찰되어 초기 미생물 생태 안정성이 저해되고 있음을 보여주었다. ANCOM-BC, LEfSe, MaAsLin2 분석에서 일관되게 Oscillospiraceae_NK4A214_group이 염증 민감성 미생물로 확인되었다. 또한 Oscillospiraceae_UCG-005, Rikenellaceae_RC9_gut_group, Monoglobus, Mailhella, Parasutterella, Alistipes 등은 PMN이 낮은 개체에서 상대적으로 풍부하였으며 이들은 반추동물에서 단쇄지방산 생성과 점막 항상성 유지에 기여하는 것으로 알려져 있다. PMN 증가군에서 이들 미생물이 감소한 것은 초기 염증 진행 과정에서 점막 장벽 안정화 및 면역 조절 기능이 약화됨을 시사한다.
한편 MaAsLin2 분석에서는 염증과 직접적으로 관련되지 않으면서 임신에 성공한 개체에서 풍부하게 나타나는 미생물군인 Faecalibacterium, Prevotella_7, Parabacteroides, Luteimonas, Methylorubrum, Aerococcus, 그리고 Enhydrobacter가 확인되었다. 이러한 임신 연관 미생물은 PMN 기반 염증 상태와 독립적으로 자궁 수용성에 기여할 수 있는 지표로 해석된다.
혈액학적 검사는 대부분 생리적 정상 범위 내에 있었으며 이는 초기 자궁 염증이 전신적 혈액학적 변화 없이 국소적으로 존재할 수 있음을 보여준다. 개체 간 경미한 변동은 CBC가 단독 진단 지표라기보다는 PMN, 사이토카인, 미생물균총과 함께 해석될 때 의미가 강화됨을 시사한다.
종합적으로 육성우에서 PMN의 경미한 증가, IL-6의 동반 상승, 단쇄지방산 관련 미생물 감소, 수태 성공율 저하는 서로 긴밀하게 연결된 초기 자궁 염증의 생물학적 특징으로 나타났다. 약 5% 수준의 PMN은 수정란 이식 성공 여부를 예측하는 데 생물학적으로 의미 있는 전환점으로 판단되며 세포학, 면역학, 미생물학적 지표를 통합한 접근은 육성우 단계에서의 자궁 건강 평가를 위한 유용한 진단 체계가 될 수 있다. 본 연구는 초기 자궁 염증의 조기 탐지와 번식 관리 효율 향상을 위한 육성우 특이적 진단 프레임워크의 기초 근거를 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract III
• Table of Contents V
• List of Tables VII
• List of Figures VIII
• List of Abbreviations X
• Introduction 1
• Review of literature 6
• 1. Definition and Diagnostic Importance of Subclinical Endometritis (SCE) 6
• 2. Diagnostic Criteria and Methodological Variations 10
• 3. Breed- and Stage-Specific Factors in PMN% Interpretation 12
• 4. Inflammatory Cytokines and Immunopathology of the Uterus 14
• 4.1 Cytokine Activation and Immune Dynamics in the Uterus 15
• 4.2 Cytokines and Fertility Outcomes 15
• 4.3 Integrative Diagnostic Value: Linking Cytology and Cytokines 16
• 4.4 Mechanistic Basis of Cytokine Dysregulation 16
• 4.5 Limitations and Future Directions 17
• 4.6 Summary 17
• 5. Uterine Microbiota, Dysbiosis, and SCFA-Mediated Immune Regulation 18
• 5.1 Commensal Microbiota and Their Role in Uterine Homeostasis 19
• 5.2 Dysbiosis and the Pathogenesis of Subclinical Endometritis 22
• 5.3 Short-Chain Fatty Acids as Mediators of Immune Tolerance 23
• 5.4 Systemic Influence of Uterine Microbial Metabolites 23
• 5.5 Functional Microbiome Alterations and Disease Prediction 24
• 5.6 Clinical and Therapeutic Implications 24
• 5.7 Knowledge Gaps and Future Directions 24
• 5.8 Summary 25
• 6. Stress-Inflammation-Microbiota Axis in Holstein Cows 25
• 7. Systemic Immune Indicators and Hematological Profiles 28
• 8. Establishing Holstein-specific diagnostic criteria for uterine inflammation 30
• Materials and methods 34
• 1. Animals and Study Design 34
• 2. PMN cytology 36
• 3. Uterine microbiome 37
• 4. Serum cytokines 38
• 5. Hematology 39
• 6. Embryo transfer and outcome assessment 39
• 7. Data analysis and statistics 40
• Results 43
• 1. PMN% and Inflammatory Cytokine Profiles 43
• 2. Uterine Microbiota Profiles 44
• 3. Complete Blood Count (CBC) Results 50
• 4. Reproductive Performance 53
• 5. Integrated Analysis 58
• Discussion 63
• 1. Interpretation of PMN profiles for Holstein heifer 63
• 2. Cytokine Profiles and Immune Dynamics 65
• 3. Hematological Profiles in Systemic Immune Context 66
• 4. Relationship between Microbiota Diversity and Functional Shifts 67
• 5. Genus-Level Patterns and Taxon-Specific Signals 68
• 6. Pregnancy-Associated Microbial Signatures 70
• 7. Integrated Microbiota-Immune-Fertility Framework 72
• 8. Clinical and Diagnostic Implications 74
• 9. Limitations and Future Perspectives 76
• Conclusion 79
• References 82
• Abstract in Korean 86