Human Recellularization for Xenoantigen-Free Decellularized Cardiovascular Xenografts = 이종항원 제거 탈세포화 심혈관 이종 이식편의 인간 유래 세포 재세포화 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The elimination of major xenoantigens, including the Galα1–3Gal (α–Gal) epitope and the nonhuman sialic acid, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc), is crucial to reduce xenogeneic immunogenicity and optimize recellularization for cardiovascular xenografts. In this study, we evaluated a dual-enzyme strategy using α–galactosidase to remove α–Gal xenoantigens and peptide N-glycosidase F (PNGase-F) to remove non–α–Gal xenoantigens, combined with optimized decellularization. Biomechanical testing and lectin staining confirmed that α-galactosidase and PNGase-F treatment markedly reduced lectin fluorescence while maintaining tissue integrity, demonstrating that the dual-enzyme treatment effectively and synergistically eliminated xenoantigens.
Decellularized xenografts are promising scaffolds for cardiac valves; however, their clinical application remains limited owing to residual immunogenicity, poor regenerative capacity, and a tendency to degenerate. Several of these limitations could be overcome through optimized dual-enzyme treatment and subsequent xenograft tissue recellularization with allogenic mesenchymal stem cells (MSCs).
For in vitro recellularization, human adipose-derived stem cells (hADSCs) were cocultured with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The dual-enzyme–treated porcine pericardial scaffolds were further modified with fibrin-heparin-vascular endothelial growth factor (VEGF) coatings and then seeded with hADSCs and HUVECs, which accelerated recellularization. Immunofluorescence analysis of vimentin, fibronectin, calponin, CD31, and vWF demonstrated cell infiltration into the tissue, and progressive differentiation into endothelial and interstitial cells.
Similarly, to address a clinically applicable recellularization strategy, we conducted recellularization using hADSCs monoculture. Although the progression was slower than in coculture, greater expression of vimentin, calponin and fibronectin indicated interstitial–like cell differentiation of MSCs and extracellular matrix (ECM) that facilitated cell adhesion and migration. Simultaneously, the expression of CD31 and vWF colocalized with phalloidin, indicating endothelial differentiation and cytoskeletal organization, thereby confirming successful recellularization.
To our knowledge, this is the first describing the successful generation of major xenoantigen-free scaffolds through the synergistic effects of α-galactosidase and PNGase-F coenzyme treatment, validated for biocompatibility, reduced immunogenicity, and enhanced by hADSCs–based endothelial cell coculture and monoculture recellularization. This dual-enzyme and stem cell–based recellularization strategy effectively promotes functional repopulation, endothelial differentiation, offering a practical and scalable pathway toward next–generation tissue–engineered heart valves.

국문 초록 (Abstract)

Galα1–3Gal (α-Gal) 에피토프와 비인간 시알산인 N–글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc)을 포함한 주요 이종항원의 제거는 이종이식편의 면역원성을 감소시키고 심혈관 이종이식편의 재세포화를 최적화를 위해 필수적이다. 본 연구에서는 α-Gal 이종항원 제거를 위한 α–갈락토시다아제 (α-galactosidase)와 비–α-Gal 이종항원 제거를 위한 펩타이드 N–글리코시다아제 F (PNGase-F)를 병용하는 이중 효소 처리 전략을, 최적화된 탈세포화 과정과 결합하여 평가하였다. 생체역학적 시험과 렉틴 염색을 통해 α-galactosidase와 PNGase-F 처리로 렉틴 형광 신호가 현저히 감소하면서도 조직의 구조적 무결성은 유지됨이 확인되었으며, 이는 이중 효소 처리를 통한 항원의 상호 보완적이고 효과적인 제거를 보여주었다.
탈세포화된 이종이식 조직은 유망한 생체지지체이지만, 잔여 면역원성, 제한된 재생능, 퇴행경향으로 인해 임상 적용에는 제약이 있다. 우리는 이러한 한계가 최적화된 이중 효소 처리와 동종 중간엽 줄기세포를 이용한 이종이식편 재세포화를 통해 극복될 수 있다고 가정하였다.
시험관 내 재세포화를 위해 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 (hADSCs)와 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 공배양하였다. 이중 효소 처리된 돼지 심낭 스캐폴드는 피브린–헤파린–VEGF 코팅으로 추가 개질한 후, hADSCs와 HUVECs를 파종한 결과 재세포화가 가속화되었다. 면역형광 염색(vimentin, fibronectin, calponin, CD31, vWF)를 통해 내피세포 및 간질세포 유사 표현형으로의 점진적인 분화를 확인하였다.
유사하게 임상 적용 가능한 재세포화 전략을 확립하기 위해, 동일한 조건에서 hADSCs 단일배양을 통한 재세포화도 수행하였다. 공배양에 비해 진행속도는 느렸으나, 강한 vimentin과 fibronectin 발현이 관찰되어 간질세포 유사 분화와 ECM의 재구성이 이루어졌음을 확인하였다. 또한 CD31 및 vWF 발현이 phalloidin 공발현과 함께 관찰되어 내피세포 분화와 세포골격 형성됨을 입증 하였다.
저자들이 아는 한 본 연구는 α-galactosidase와 PNGase-F의 병용 효소 처리의 시너지 효과를 통해 주요 이종항원이 제거된 스캐폴드를 성공적으로 생성하고, 생체적합성과 면역원성 감소를 검증하였으며, 나아가 hADSC 기반의 내피세포 공배양 또는 단일배양 재세포화 전략을 통해 이를 강화한 최초의 연구이다. 이러한 이중 효소 및 줄기세포 기반 접근법은 차세대 재세포화 조직공학 심장판막 개발을 위한 효율적이고 임상적으로 확장 가능한 플랫폼으로서의 가능성을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents iv
• Abbreviation List v
• List of Figures vii
• Introduction 1
• Materials and Methods 4
• Results 15
• Discussion 54
• Conclusion 63
• Bibliography 64
• Abstract in Korean 72
• Acknowledgements 74