Functional Restoration of a Mitochondrial Deafness?Causing SSBP1 Mutation via Base Editing and Mitochondrial Transplantation = 염기 교정 및 미토콘드리아 이식을 통한 미토콘드리아 난청 유발 SSBP1 변이의 기능적 회복

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndromes caused by mutations in nuclear genes regulating mtDNA replication result in severe mitochondrial dysfunction. Through whole-genome sequencing, I identified a novel heterozygous mutation (c.272G>A:p.Arg91Gln) in single-stranded DNA-binding protein 1 (SSBP1), a key component of the mitochondrial replisome, in a patient exhibiting sensorineural deafness, congenital cataract, optic atrophy, macular dystrophy, and myopathy. Functional analyses revealed that this mutation disrupted SSBP1 multimerization and reduced DNA-binding affinity, leading to impaired mtDNA replication and defective oxidative phosphorylation (OXPHOS).
To restore mitochondrial function, I employed adenine base editing (ABE) in patient-derived fibroblasts. Among the variants tested, NG-Cas9-based ABE8e achieved efficient correction (up to 30%) and markedly improved mitochondrial bioenergetics, whereas NG-ABE8eWQ exhibited fewer off-target effects with moderate editing efficiency (up to 10%). Both variants successfully increased mtDNA copy number and OXPHOS protein expression, confirming functional recovery.
In parallel, I explored mitochondrial transplantation as a mutation-independent therapeutic approach using PN-101, a clinical-grade mitochondrial preparation derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs). PN-101 mitochondria were successfully internalized into SSBP1-mutant fibroblasts, significantly increasing mtDNA copy number, OXPHOS complex expression, and oxygen consumption rate in a time- and dose-dependent manner.
Collectively, this study demonstrates two complementary strategies—precise correction by base editing and functional restoration through mitochondrial transplantation—for the treatment of SSBP1-related mtDNA depletion syndrome. These findings establish a translational framework for multimodal therapies targeting primary mitochondrial diseases.

국문 초록 (Abstract)

미토콘드리아 DNA(mtDNA) 복제에 관여하는 핵 유전자의 돌연변이는 미토콘드리아 기능 저하와 mtDNA 감소를 유발한다. 본 연구에서는 전장 유전체 분석을 통해 미토콘드리아 복제 복합체의 핵심 구성요소인 single-stranded DNA-binding protein 1 (SSBP1) 유전자에서 새로운 이형접합 변이(c.272G>A:p.Arg91Gln)를 확인하였다. 해당 변이를 가진 환자는 감각신경성 난청, 선천성 백내장, 시신경 위축, 황반변성, 근병증을 동반하였다. 미토콘드리아의 기능적 분석 결과, 이 변이는 SSBP1의 다량체 형성 및 DNA 결합 친화성을 저해하여 mtDNA 복제 효율을 감소시키고 산화적 인산화(OXPHOS) 기능을 손상시킴을 확인하였다.
이 변이를 교정하기 위해 환자 유래 섬유아세포에서 아데닌 염기교정(Adenine Base Editing, ABE)을 적용하였다. 그 결과, NG-Cas9 기반 ABE8e는 약 30%의 교정 효율을 보이며 미토콘드리아 생합성과 기능을 유의하게 향상시켰고, 변형형 NG-ABE8eWQ는 교정 효율은 약 10%로 낮았으나 비표적(off-target) 교정이 거의 없어 더 안전한 치료법임을 나타냈다. 두 방법 모두 mtDNA 복제수와 OXPHOS 단백질 발현을 회복시켜 미토콘드리아 기능이 정상화되었음을 확인하였다.
또한, 비유전적 표적 치료 전략으로서 인간 제대혈 유래 중간엽줄기세포(human UC-MSCs)로부터 분리한 임상용 미토콘드리아 제제 PN-101을 이용한 미토콘드리아 이식의 치료 가능성을 확인하였다. PN-101은 환자 유래 섬유아세포 내로 성공적으로 전달되어, 시간 및 농도 의존적으로 mtDNA 복제수, OXPHOS 복합체 단백질 발현, 산소소모율(OCR)을 유의하게 증가시켰다.
본 연구는 염기교정을 통한 정밀 유전자 교정과 미토콘드리아 이식을 통한 기능적 복원이라는 상보적 치료 전략을 제시함으로써, SSBP1 변이 관련 mtDNA 감소 증후군을 포함한 1차 미토콘드리아 질환의 다중 치료 접근법 확립에 중요한 근거를 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstarct ⅰ
• Conents ⅲ
• List of tables and figures ⅴ
• Chapter 1 1
• General introduction
• Chapter 2 5
• Introduction 6
• Material and Methods 10
• Results 23
• Discussion 75
• Chapter 3 80
• Introduction 81
• Material and Methods 86
• Results 91
• Discussion 100
• Chapter 4 104
• Overall Discussion and Conclusion
• Bibliography 106
• Abstact in Korean 111