Functional characterization of HexC as a modulator of HexA-mediated transcriptional regulation and acid stress response in Pectobacterium carotovorum = Pectobacterium carotovorum에서 HexA 의존적 전사 조절과 산성 스트레스에 대한 HexC의 역할

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Plant-pathogenic bacteria encounter dynamic environmental conditions and host-imposed stresses during infection, requiring precise transcriptional regulation for survival and disease progression. Pectobacterium carotovorum, a necrotrophic pathogen causing soft rot in diverse crops, relies on transcriptional networks to regulate virulence. Among various global regulators, the LysR-type regulator HexA has been described as a repressor of plant cell wall–degrading enzymes (PCWDEs), quorum sensing (QS), and pathogenicity, yet its broader roles remain unclear. To further characterize the HexA regulon in P. carotovorum PCC27, an integrative approach combining chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) and transcriptome profiling (RNA-seq) was conducted. This analysis revealed that HexA controls a broad set of targets, including transcriptional regulators, hypothetical proteins, and post-transcriptional factors such as RsmA and RsmB. Among these, HexC, annotated as a hypothetical protein was identified as a HexA-interacting partner that enhances its DNA-binding activity. Biochemical and genetic assays demonstrated that HexC acts as a co-repressor, reinforcing HexA-mediated regulation. Loss of HexA led to derepression of PCWDE genes and elevated QS production, while the hexA/hexC double mutant generated even higher QS levels without a proportional increase in virulence. The double mutant also showed impaired growth under acidic conditions but outcompeted the wild type in neutral pH medium. In contrast, in planta assays consistently showed reduced fitness of hexA, hexC, and hexA/hexC mutants compared with the wild type in both single and co-infections. Collectively, these findings identify HexC as a regulatory partner that strengthens HexA function and provide insight into how transcriptional regulation adapts and evolves under variable environmental conditions.

국문 초록 (Abstract)

식물병원성 세균은 감염 과정에서 숙주로부터 유래하는 다양한 환경적 스트레스에 직면하며, 생존과 병원성 발현을 위해 정교한 전사 조절 기작이 요구된다. 연부병을 유발하는 괴사성 병원균인 Pectobacterium carotovorum은 병원성 인자의 발현을 조절하기 위해 복합적인 전사 조절 네트워크에 의존한다. 이들 조절자 중 LysR 계열 전사 조절자인 HexA는 식물 세포벽 분해 효소(plant cell wall–degrading enzymes, PCWDEs), quorum sensing(QS), 그리고 병원성의 억제자로 알려져 있으나, 그 기능적 역할과 조절 범위에 대해서는 충분히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 P. carotovorum PCC27에서 HexA 조절 네트워크를 보다 심층적으로 규명하기 위하여, chromatin immunoprecipitation sequencing(ChIP-seq)과 transcriptome 분석(RNA-seq)을 결합한 통합 분석을 수행하였다. 그 결과, HexA는 다양한 전사 조절자, 가설적 단백질, 그리고 RsmA 및 RsmB와 같은 전사 후 조절 인자를 포함한 광범위한 표적 유전자를 조절함을 확인하였다. 이들 중 가설적 단백질로 주석되어 있던 HexC는 HexA와 물리적으로 상호작용하며, HexA의 DNA 결합 활성을 증강시키는 조절 파트너로 동정되었다. 생화학적 및 유전학적 분석을 통해 HexC는 HexA 매개 전사 조절을 강화하는 공동 억제자로 기능함을 확인하였다. hexA 결실 변이는 PCWDE 유전자의 탈억제와 QS 신호 생성의 증가를 유도하였으며, hexA/hexC 이중 결실 변이는 병원성의 추가적인 증가 없이 더욱 높은 QS 신호 생성을 나타내었다. 또한 이중 결실 변이는 산성 조건에서 생장 결함을 보인 반면, 중성 pH 조건에서는 야생형 균주를 경쟁적으로 우점하는 양상을 보였다. 그러나 식물체 감염 실험에서는 단일 및 공동 감염 조건 모두에서 hexA, hexC, 그리고 hexA/hexC 결실 균주가 야생형에 비해 일관되게 낮은 적합도를 나타냈다. 종합적으로 본 연구는 HexC가 HexA 기능을 강화하는 새로운 전사 조절 파트너임을 규명하였으며, 이를 통해 식물병원성 세균에서 환경 변화에 대응하는 전사 조절 기작의 적응과 진화에 대한 이해를 확장한다.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Materials and methods 5
• Ⅰ. Bacterial strains and growth conditions 5
• Ⅱ. Construction of mutant and complemented strains 5
• Ⅲ. Chromatin immunoprecipitation and sequencing (ChIP-seq) analysis 6
• Ⅳ. RNA-seq analysis 8
• Ⅴ. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) 9
• Ⅵ. Overexpression and purification of HexA and HexC proteins 10
• Ⅶ. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 11
• Ⅷ. Autoinducer assay 12
• Ⅸ. Plant cell wall–degrading enzyme activity assays 12
• Ⅹ. Virulence assay 14
• ⅩⅠ. Bacterial growth monitoring and competition assay in LB medium and in planta 14
• ⅩⅢ. Identification of AHLs produced by PCC27 using LC-TOFMS 16
• ⅩⅣ. Statistical analysis 17
• Results 18
• Ⅰ. Genome-wide identification of HexA-regulated genes by integrated ChIP-seq and RNA-seq analyses 18
• Ⅱ. Direct binding of HexA to promoter regions of selected target genes 20
• Ⅲ. Role of HexA target genes in virulence and quorum-sensing regulation 21
• Ⅳ. Direct binding of HexA to the promoter regions of the rsm system 23
• Ⅴ. HexC functions as a co-repressor enhancing HexA-mediated transcriptional repression 24
• Ⅵ. Cooperative role of HexA and HexC in acid stress response 26
• Ⅶ. Context-dependent fitness effects of HexA–HexC regulation in vitro and in planta 26
• Ⅷ. Regulation of the chaperone gene htpG links HexA–HexC control to acid stress adaptation 27
• Discussion 29
• Acknowledgement 62
• Literature citted 63
• Abstract in Korean 70