Exosomal microRNA Analysis in Girls with Idiopathic Central Precocious Puberty = 여아의 특발성 중추성 성조숙증에서 엑소좀 마이크로 RNA 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Idiopathic central precocious puberty (CPP) is defined as the early onset of puberty resulting from premature activation of the hypothalamic–pituitary–gonadal (HPG) axis. Although the incidence of CPP in girls has increased markedly in recent years, its underlying molecular mechanisms remain incompletely understood. MicroRNAs (miRNAs) are non-coding RNAs that regulate gene expression by inhibiting the translation of target genes and are recognized as important epigenetic regulators of pubertal development. MiRNAs encapsulated within exosomes are stably present in the circulation and can cross the blood–brain barrier, making them promising biomarkers that may reflect central regulatory mechanisms. Apart from reports describing increased expression of miR-30b-5p during puberty, human studies investigating miRNAs associated with CPP remain limited. Therefore, this study aimed to characterize serum exosomal miRNA expression profiles in girls with CPP and to explore their functional relevance in pubertal regulation.
This cross-sectional study included 19 girls aged 6–8 years, comprising 9 girls with CPP and 10 age-matched prepubertal controls. Serum exosomes were isolated, and miRNA sequencing was performed using the Ion Torrent S5 platform. Differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) between groups were identified, and their biological significance was evaluated through pathway enrichment and network-based analyses using the TargetScan, KEGG, and SIGNOR databases. Finally, a leave-one-out cross-validation (LOOCV)-based least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) approach was applied to identify an optimal miRNA panel for CPP discrimination.
A total of 1,734 serum exosomal miRNAs were detected, of which 120 were upregulated and 114 were downregulated in the CPP group compared with controls. Hierarchical clustering revealed distinct global miRNA expression profiles between CPP and control samples. Several miRNAs previously linked to pubertal onset, including let-7, miR-29, miR-429, miR-7, miR-15a, and miR-664, were among the DEmiRNAs. Notably, miR-30b-5p was significantly upregulated (fold change = 1.8, adjusted p = 0.01), supporting its reported role in HPG axis activation via suppression of MKRN3. Topology-integrated pathway analysis revealed activation of endocrine and neurodevelopment-related pathways, including gonadotropin-releasing hormone, estrogen, thyroid hormone, growth hormone, and Wnt signaling, whereas metabolic and inflammatory pathways such as MAPK, AGE–RAGE, AMPK, FoxO, and mTOR signaling were suppressed in the CPP group. A seven-miRNA diagnostic panel consisting of miR-451a, miR-22-3p, miR-20a-5p, miR-15a-5p, miR-17-3p, miR-19b-3p, and miR-29b-3p was derived, which clearly discriminated CPP from controls within this dataset (AUC = 1.00), although it did not completely distinguish CPP from premature thelarche.
In conclusion, this study demonstrates that serum exosomal miRNA expression profiles in girls with CPP differ significantly from those of prepubertal controls, reflecting a coordinated network of endocrine activation and metabolic adaptation. These findings provide new insights into the epigenetic regulation of pubertal onset and suggest that exosomal miRNAs may serve as potential non-invasive biomarkers for CPP.

국문 초록 (Abstract)

특발성 중추성 성조숙증(central precocious puberty, CPP)은 시상하부–뇌하수체–생식선(hypothalamic–pituitary–gonadal) 축의 조기 활성화로 인한 사춘기 조기 발현이다. 최근 여아에서 CPP의 발생률이 현저히 증가하고 있으나, 그 분자적 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 마이크로RNA(microRNA, miRNA)는 표적 유전자의 번역을 억제하여 유전자 발현을 조절하는 비암호화 RNA로, 사춘기 조절의 중요한 후성유전학적 매개체로 알려져 있다. 엑소좀(exosome)에 포함된 miRNA는 혈중에서 안정적으로 존재하며 혈뇌장벽(blood–brain barrier)을 통과할 수 있어 중추신경계의 조절 기전을 반영할 수 있는 표지자로 평가된다. 사춘기 시기에 miR-30b-5p의 발현 증가가 보고된 바 있으나, CPP와 관련된 miRNA의 인간 대상 연구는 현재까지 제한적이다. 이에 본 연구는 여아의 CPP에서 혈청 exosomal miRNA의 발현 양상을 분석하고 사춘기 조절과 관련된 기능적 의미를 탐색하고자 하였다.
본 연구는 6–8세 여아 19명을 대상으로 한 단면 연구로, CPP군 9명과 정상 대조군 10명을 포함하였다. 혈청 exosome을 분리한 후 Ion Torrent S5 플랫폼을 이용하여 miRNA 염기서열을 분석하였다. 군 간 발현 차이를 확인하여 차등 발현 microRNA (differentially expressed microRNA, DEmiRNA)를 선별하였으며, TargetScan, KEGG, SIGNOR 데이터베이스를 이용한 pathway enrichment 및 네트워크 기반 경로 분석을 통해 생물학적 의미를 평가하였다. 마지막으로, leave-one-out 교차검증(leave-one-out cross-validation, LOOCV)을 적용한 최소 절대 수축 및 선택 연산자(least absolute shrinkage and selection operator, LASSO) 방법을 이용하여 CPP 진단에 최적인 miRNA 패널을 선정하였다.
총 1,734개의 혈청 exosomal miRNA가 검출되었으며, 이 중 120개의 miRNA가 대조군에 비해 CPP군에서 상향 조절되었고, 114개가 하향 조절되었다. 전체 miRNA의 발현 패턴에 따라 위계적 군집분석(hierarchical clustering)을 하였을 때 CPP군과 대조군이 뚜렷하게 구별되었다. DEmiRNA를 살펴보았을 때, let-7, miR-29, miR-429, miR-7, miR-15a, miR-664 등 이전 동물 실험 또는 세포 실험에서 사춘기 발현과 관련성이 알려진 miRNA들이 확인되었다. miR-30b-5p는 CPP군에서 유의하게 높게 발현되었다(adjusted p = 0.01). 경로 분석 결과, CPP군에서는 GnRH, 에스트로겐, 갑상선호르몬, 성장호르몬, Wnt 신호 등 내분비 및 신경발달 관련 경로가 활성화되고, MAPK, AGE–RAGE, AMPK, FoxO, mTOR 등 대사 및 염증 관련 경로는 억제되는 양상이 나타났다. CPP를 찾아낼 수 있는 miRNA를 선별하여 miR-451a, miR-22-3p, miR-20a-5p, miR-15a-5p, miR-17-3p, miR-19b-3p, miR-29b-3p 로 구성된 7종의 miRNA 패널을 도출하였으며 본 데이터셋 내에서 CPP와 대조군을 명확히 구분하였으나(AUC = 1.00), 조기유방발육증(premature thelarche, PT)을 CPP와 완벽히 구별하지는 못하였다.
본 연구는 여아의 CPP에서 혈청 exosomal miRNA의 발현 양상이 사춘기 전 정상 대조군과 다름을 확인하였다. 이는 내분비 활성화와 대사 적응이 동시에 일어나는 네트워크를 반영하는 것으로 보인다. 이 결과는 사춘기 시작의 후성유전학 조절 기전에 대한 새로운 관점을 제공하며 exosomal miRNA가 CPP의 잠재적 생체 표지자임을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Contents iii
• List of Figures and Tables iv
• Abbreviations v
• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1. Central Precocious Puberty 1
• 1.2. microRNA 2
• 1.3. Exosomal microRNA 4
• 1.4. Purpose of the Study 5
• Chapter 2. Materials and Methods 7
• 2.1. Study Design and Participants 7
• 2.2. Anthropometric and Biochemical Measurements 8
• 2.3. Exosomal microRNA Sequencing 9
• 2.4. Differential microRNA Expression Analysis 12
• 2.5. Pathway Enrichment and Activity Analysis 13
• 2.6. Prediction of Candidate microRNA Panel Using LASSO 18
• Chapter 3. Results 21
• 3.1. Clinical Characteristics 21
• 3.2. Distinct Exosomal miRNA Expression Patterns in CPP 21
• 3.3. Differentially Expressed microRNAs 26
• 3.4. Pathway Enrichment Analysis of DEmiRNAs 38
• 3.5. Prediction of Candidate microRNA Panel 42
• Chapter 4. Discussion 49
• 4.1. Distinct microRNA Expression Patterns in CPP 49
• 4.2. Biological Implications of Differentially Expressed microRNAs 50
• 4.3. Pathway and Network-Level Alterations in CPP 56
• 4.4. Clinical Implications of the microRNA Diagnostic Panel 59
• 4.5. Limitations and Future Directions 63
• Chapter 5. Conclusion 65
• References 66
• Abstract in Korean 74