Epigenetic Aging Signatures and DNA Methylation-based Age Prediction in Human Skeletal Muscle = 인간 골격근에서 후성유전학적 노화 지표와 DNA 메틸화 기반 연령 예측에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

노화는 점진적인 분자적 및 세포적 변화를 유도하여 골격근 기능을 저하시킨다. DNA 메틸화는 이러한 과정의 핵심적인 후성유전학적 조절 인자이며, 생물학적 노화의 강력한 바이오마커로 활용되고 있다. 그러나 인간 골격근, 특히 아시아 인구집단에서의 역할은 아직 충분히 탐구되지 않았다. 더불어 기존의 대부분 모델은 대퇴외측근(vastus lateralis muscle)에 집중되어 있어, 다른 골격근 유형에 대한 예측 모델 체계는 대부분 다루어지지 않았다.
이러한 공백을 해소하기 위해, 본 연구에서는 18세에서 85세 사이의 한국인 사망자에서 부검을 통해 수집한 103개의 대흉근(pectoralis major, PM) 시료의 DNA 메틸화 프로파일을 분석하였다. 전장 메틸화 프로파일링은 Infinium EPIC array를 통해 수행되었으며, 표적 검증 및 모델 개발은 차세대 염기서열분석법(Next Generation Sequencing, NGS)과 단일 염기 연장법(Single Base Extension, SBE) 플랫폼을 활용하였다. 선택된 CpG 위치를 기반으로 연령 예측 모델을 구축하기 위해 기계학습 알고리즘을 적용하였으며, Pearson 상관계수(r), 결정계수(R²), 평균절대오차(Mean Absolute Error, MAE), 평균 제곱근 오차(Root Mean Square Error, RMSE) 등을 통해 모델 성능을 평가하였다.
그 결과, 골격근에서 연령과 연관된 20개의 CpG 마커를 확인하였으며, 이들은 근육 구조, 대사, 스트레스 반응과 관련된 유전자에 연결되어 있었다. 본 결과는 DNA 메틸화가 골격근 기능 저하와 관련된 노화의 바이오 마커로서 잠재력을 지님을 보여준다. 이 20개의 CpG를 기반으로 학습된 기계학습 모델은 높은 정확도의 연령 예측력을 나타냈으며, 가장 성능이 우수한 모델은 NGS에서 5.537년, SBE에서 3.797년의 검증 세트 MAE를 달성하였다. 또한 민감도 분석을 통해 낮은 DNA 양에서도 모델의 정확성이 확인되었다. 특히, 심장근 및 평활근 조직에서는 예측 성능이 크게 감소하여, 발굴된 CpG들의 조직 특이성이 강조되었다. 20개의 마커 중 일부는 새롭게 보고된 것으로, 기존 메틸화 어레이보다 높은 분석 정밀도를 보였다.
본 연구는 아시아 인구집단에서 부검 시료를 이용하여 최초로 구축된 골격근 기반 후성유전학적 연령 예측 모델을 제시한다. 특히, EPIC array 스크리닝과 NGS 및 SBE 검증을 통합하여, 법의학적 및 임상적 응용에 적합한 강력하고 비용 효율적이며 조직 특이적인 모델을 개발하였다. 연령 추정을 넘어, 확인된 CpG 마커들은 근육 노화의 후성유전학적 구조를 이해하는 데 기여하며, 연령 관련 근육 퇴행의 잠재적 바이오 마커로 활용될 수 있다. 본 연구 결과는 인구집단 및 조직 특이적 접근법이 근육 건강과 노화 연구에서 정밀 후성유전학을 발전시키는 데 있어 중요한 의미를 지님을 보여준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Aging induces progressive molecular and cellular alterations that impair skeletal muscle function. DNA methylation is a key epigenetic regulator of these process and serves as a robust biomarker of biological aging. However, its role in human skeletal muscle, particularly in Asian populations, remains underexplored. Moreover, most existing models have focused on the vastus lateralis muscle, leaving predictive frameworks for other skeletal muscle types largely unaddressed.
To address this gap, we analyzed DNA methylation profiles from 103 pectoralis major (PM) muscle samples, collected from autopsies of South Korean individuals aged 18 to 85 years. Genome-wide methylation profiling was performed using the Infinium EPIC array. Targeted validation and model development were conducted using Next-Generation Sequencing (NGS) and Single Base Extension (SBE) platforms. Machine learning algorithms were applied to construct age prediction models using selected CpG sites. Model performance was evaluated using Pearson’s correlation coefficient (r), coefficient of determination (R²), Mean Absolute Error (MAE), and Root Mean Square Error (RMSE).
We identified 20 age-associated CpG markers in skeletal muscle, and were linked to genes involved in muscle structure, metabolism, and stress response. These findings underscore the potential of DNA methylation as a biomarker for aging-related decline in skeletal muscle function. Machine learning models trained on these 20 CpGs demonstrated high accuracy in age prediction. The best-performing models achieved test-set MAEs of 5.537 years in NGS and 3.797 years in SBE. Sensitivity analysis confirmed model robustness with low DNA input. Notably, prediction performance was significantly reduced in cardiac and smooth muscle tissues, emphasizing the tissue specificity of the identified CpGs. Among the 20 markers, several were novel, offering enhanced resolution beyond previous methylation arrays.
This study presents the first epigenetic age prediction models for skeletal muscle derived from post-mortem samples in an Asian population. By integrating EPIC array screening with NGS and SBE validation, we developed robust, cost-effective, and tissue-specific models suited for forensic and clinical applications. Beyond age estimation, the identified CpG markers provide insight into the epigenetic architecture of muscle aging and may serve as potential biomarkers for age-related muscular degeneration. Our findings offer valuable insights into the importance of population- and tissue-specific approaches in advancing precision epigenetics for muscle health and aging research.

목차 (Table of Contents)

• Abstract Ⅰ
• Contents Ⅳ
• List of Figures Ⅵ
• List of Tables Ⅷ
• List of Abbreviation Ⅸ
• Chapter 1. Introduction 1
• Chaper 2. Materials and Methods 4
• 1. Study Samples 4
• 2. Genomic DNA Extraction 4
• 3. Identification of Skeletal Muscle-specific Aging-associated CpG Sites 5
• 4. Genomic Analysis of Aging-associated Genes 6
• 5. mRNA Expression Analysis by Real-Time Quantitative PCR 6
• 6. Cross-Cohort Gene Expression Analysis Using GTEx RNA-Seq Data 7
• 7. Transcription Factor Motif Analysis 8
• 8. Chromatin context analysis using ChIP-seq data 8
• 9. Bisulfite Conversion 10
• 10. Primer Design for Methylation Analysis 10
• 11. Bisulfite Sequencing using Single Base Extension 14
• 12. Bisulfite Sequencing using Next Generation Sequencing 15
• 13. Methylation Data Processing 16
• 14. Machine Learning 17
• 15. Statistical Analysis 17
• Chapter 3. Results 18
• 1. Discovery of aging-associated CpG markers from skeletal muscle 18
• 2. Genomic analysis and functional implications of the 20 aging-associated CpG markers37
• 3. Construction and validation of age prediction model using NGS data 49
• 4. Construction and validation of age prediction model using multiplex SBE data 70
• 5. Assessment of histological applicability and model validity 81
• Chapter 4. Discussion 90
• Chapter 5. Conclusion 100
• Acknowledgement 101
• References 102
• 국문 초록 116