Elucidation of BRR2a Interactions with DME and STA1 Suggesting a Regulatory Network in Arabidopsis = 애기장대에서 DME?BRR2a와 STA1 상호작용 및 조절 네트워크 가능성 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Epigenetic regulation and RNA processing jointly contribute to developmental stability in Arabidopsis. The DNA demethylase DEMETER (DME) and the RNA splicing factor BRR2a are individually known to influence transcriptional regulation, but their mechanistic interplay remains unclear. Here, we integrated genetic, molecular, and multi-omics analyses of dme, brr2a, and sta1 mutants to elucidate the coordinated regulatory network among these factors.
We demonstrate a direct physical link between epigenetic and splicing machineries. Yeast two-hybrid and three-hybrid assays revealed that BRR2a interacts with the N-terminus of DME as well as with STA1, forming a ternary DME–BRR2a–STA1 complex. This suggests that BRR2a functions as a scaffold, facilitating the incorporation of DME into a splicing-associated regulatory module. Although the brr2a-1 allele exhibited severe seed abortion, highlighting its essential role, our focus was on the functional convergence mediated by the ternary complex.
Transcriptomic and epigenomic analyses further support the coupling of these processes. RNA sequencing revealed that dme, brr2a, and sta1 share similar Gene Ontology enrichment patterns, particularly among stress-response genes. Analysis of RdDM-related genes showed that dme displayed the most pronounced transcriptional perturbation, including downregulation of core components such as NRPD1 and DRM2. Notably, whole-genome bisulfite sequencing demonstrated that all three mutants exhibited elevated CHH hypomethylation and defects at transposable element (TE) boundaries, paralleling the methylation defects observed in dme. This indicates that defects in splicing factors can compromise RdDM-dependent DNA methylation maintenance.
Collectively, our findings uncover a mechanistic link among DME, BRR2a, and STA1, demonstrating that RNA splicing factors are integral to the maintenance of DNA methylation patterns. We propose that the DME–BRR2a–STA1 regulatory axis integrates RNA processing with DNA methylation dynamics to ensure transcriptional control and epigenetic homeostasis in Arabidopsis.

국문 초록 (Abstract)

후성유전학적 조절과 RNA 가공 과정은 애기장대의 발달 안정성에 협력적으로 기여한다. DNA 탈메틸화 효소 DEMETER (DME)와 RNA 스플라이싱 인자인 BRR2a는 각각 전사 조절에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 이들 간의 기전적 연관성은 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 dme, brr2a, sta1 돌연변이체를 대상으로 유전학적, 분자 생물학적, 멀티오믹스 분석을 통합하여 이들 인자 간의 협력적 조절 네트워크를 규명하였다.
우선 후성유전 조절 인자와 스플라이싱 인자 사이의 직접적 상호작용을 실험적으로 확인하였다. Yeast two-hybrid 및 three-hybrid 분석을 통해 BRR2a가 DME의 N-말단과 STA1 모두와 상호작용하며, DME–BRR2a–STA1 삼중 복합체를 형성함을 밝혔다. 이는 BRR2a가 DME를 스플라이싱 관련 조절 모듈과 연결하는 핵심 매개자로 기능함을 의미한다. 또한 brr2a-1 대립유전자가 심각한 종자 결실 (seed abortion) 표현형을 나타내어 BRR2a의 필수적 기능을 재확인하였으나, 본 연구의 초점은 삼중 복합체 형성을 통한 두 조절 기작의 기능적 수렴에 두었다.
전사체와 후성유전체 분석 결과 역시 이러한 연계를 지지하였다. RNA 시퀀싱 분석에서 dme, brr2a, sta1은 특히 스트레스 반응 관련 유전자군에서 유사한 유전자 온톨로지 (GO) 농축 패턴을 보였다. RdDM 경로 유전자들의 발현 분석에서는 dme가 NRPD1, DRM2 등 핵심 인자의 발현 감소를 포함하여 가장 두드러진 교란을 보였으나, 세 돌연변이체 모두 CHH 저메틸화 증가와 전이인자 (TE) 경계 부위에서의 메틸화 손상을 공유하는 것으로 나타났다. 이는 스플라이싱 인자의 결함이 RdDM 의존적 메틸화 유지 기작에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
종합적으로, 본 연구는 DME, BRR2a, STA1 사이의 기전적 연결고리를 밝힘과 동시에 RNA 스플라이싱 인자들이 DNA 메틸화 패턴의 안정적 유지에 필수적임을 제시하며, DME–BRR2a–STA1 축이 RNA 가공과 DNA 메틸화 역동성을 통합하여 애기장대의 전사 조절 및 후성유전학적 항상성을 유지하는 새로운 조절 모델을 제안한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract 1
• Table of Contents 3
• List of Figures 5
• 1. Introduction 6
• 1.1 DNA Methylation Dynamics in Plants 6
• 1.2 Active DNA Demethylation by DEMETER (DME) 8
• 1.3 The Emerging Link Between RNA Splicing and Chromatin Modifiers 8
• 1.4 Research Objectives 9
• 2. Materials and Methods 10
• 2.1 Plant materials and growth condition 10
• 2.2 Yeast hybrid assays 10
• 2.3 RNA sequencing 11
• 2.4 Whole genome bisulfite sequencing 12
• 2.5 Identification of differentially methylated regions 12
• 3. Results 13
• 3.1 Mutants of BRR2a exhibit seed abortion phenotype 13
• 3.2 Observation of BRR2a expression pattern 15
• 3.3 DME. N-M domain mainly interacts with BRR2a 17
• 3.4 BRR2a Mediates the Formation of a Ternary Complex with DME and STA1 19
• 3.5 Differential Gene Expression Analysis in dme, brr2a, and sta1 Mutants 22
• 3.6 Enrichment of Chemical and Auxin Response Genes in the Shared Transcriptome of the Mutants 24
• 3.7 Expression Changes of RdDM Pathway Genes 26
• 3.8 Altered DNA Methylation Landscapes in dme, brr2a, and sta1 Mutants 28
• 3.9 Differential DNA Methylation Profiles Across the Three Mutants 31
• 3.10 Distribution of Differentially Methylated Genes in Promoter and Gene Body Regions 33
• 3.11 Impact of promoter CHH hypomethylation on gene expression in dme, sta1, and brr2a mutants 35
• 4. Discussion 37
• References 39
• Abstract in Korean 42