Effects of cholesterol on mitophagy and inflammasome activation in SH-SY5Y cells = SH-SY5Y 신경세포 내 콜레스테롤 축적이 미토파지 및 인플라마좀 활성에 미치는 영향

국문 초록 (Abstract)

뇌에는 체내 전체 콜레스테롤의 약 25%가 존재하며, 신경세포 기능 유지에 중요한 역할을 한다. 선행연구에서 고콜레스테롤 식이 섭취 시 혈액-뇌 장벽 투과성이 높아져 콜레스테롤 항상성에 이상이 생길 수 있음이 밝혀졌다. 뉴런은 높은 에너지 요구량을 가지므로 정상적인 미토콘드리아 기능이 필수적이다. 미토콘드리아의 기능 저하가 나타나면 미토콘드리아 항상성 유지를 위해 미토콘드리아 생합성이나 미토파지와 같은 반응을 유도할 수 있다. 또한, 미토콘드리아의 기능 손상은 세포질로의 미토콘드리아 DNA 유출을 증가시켜 인플라마좀 활성화 신호 역할을 할 수 있다. 선행연구에 따르면 과도한 콜레스테롤은 미토콘드리아 기능을 저하시켜 미토콘드리아 막전위를 낮추고 산화 스트레스를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 유전자 조작을 통해 알츠하이머병 모델에 콜레스테롤까지 축적시킨 마우스에서 오토파지 수용체인 optineurin이 제대로 동원되지 않아 미토파지가 제대로 일어나지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 연구에서는 고콜레스테롤혈증 상황에서의 SH-SY5Y 세포에서 콜레스테롤 축적으로 인한 미토콘드리아 손상이 미토파지와 인플라마좀에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. SH-SY5Y 인간 신경세포주를 사용하여25 또는 50 µg/mL 수용성 콜레스테롤을 포함한 배지에서 24시간 처리하였다. 세포 내 총 콜레스테롤은 비색법으로 측정하였고, 세포 생존율은 trypan blue 분석으로 평가하였다. DNA 손상은 comet assay로 평가하였으며, 미토콘드리아 막전위와 ROS 생성은 형광 기반 분석, ATP 생성은 발광 기반 분석으로 측정하였다. 단백질 발현은 Western blotting으로 분석하였고, mRNA 및 DNA 수준은 RT-qPCR과 PCR 분석으로 측정하였다. 콜레스테롤 처리로 세포 내 콜레스테롤이 50 µg/mL에서 최대 1.7배 증가하였고, 농도의존적으로 세포독성이 유발되었다. 콜레스테롤을 처리한 세포에서DNA 손상 증가가 나타났으며 및 50 µg/mL에서 Tau 단백질 인산화 증가를 통해 세포 손상과 신경세포 퇴행 가능성이 관찰되었다. 또한 SH-SY5Y 세포에서 50 µg/mL 콜레스테롤 처리 후 CHOP mRNA와 cleaved caspase-3의 단백질 수준이 증가하여 세포 사멸이 관찰되었다. 콜레스테롤 50 µg/mL 처리군에서 미토콘드리아 막전위를 감소시켰으며 이는 cleaved caspase-9의 단백질 수준 증가와 함께 미토콘드리아 매개 사멸이 유발되었음을 보여준다. 콜레스테롤 50 µg/mL 처리는 활성산소종 생성을 증가시키고, ATP 생성을 감소시켜 미토콘드리아 기능저하를 시사하였다. 콜레스테롤 50 µg/mL 처리 후 PPARGC1A mRNA 수준 증가를 통해 미토콘드리아 생합성이 증가함을 확인하였으나, 전체 미토콘드리아 DNA 수는 감소하였다. 콜레스테롤 처리는 미토파지의 초기 단계를 활성화했으며, 이는 미토콘드리아 분획에서 PINK1, Parkin, 유비퀴틴 인산화 형태의 단백질 수준 증가로 확인되었다. 그러나 microtubule-associated protein light chain 3B -II 와 p62의 단백질 수준 증가로 오토파고좀 분해 단계가 저해되었을 가능성을 보여주었다. 오토파고좀 분해 단계 저해는 오토파지 저해제인 chloroquine 처리한 후 오토파지 플럭스를 측정하여 추가적으로 확인하였다. 콜레스테롤 50 µg/mL 처리군에서 세포질 분획에서의 미토콘드리아 DNA 수 수준이 증가하여 세포질 내 미토콘드리아 DNA축적이 증가했음을 확인하였다. 또한 CASP1 mRNA 수준이 증가하고 interleukin 1 beta의 배지로의 분비가 증가하여 인플라마좀 활성화가 유도되었음을 시사하였다. 종합하면, SH-SY5Y 세포 내 콜레스테롤의 축적은 콜레스테롤은 미토파지 상위 신호를 활성화하지만, 오토파지 플럭스 저해로 인해 오토파고좀이 제거되지 못하여 손상된 미토콘드리아가 지속적으로 남아 있을 수 있다. 이러한 지속적인 미토콘드리아 스트레스는 세포질로의 미토콘드리아DNA 유출 및 interleukin 1 beta 분비 증가로 이어졌을 가능성을 보여준다. 고콜레스테롤혈증이 콜레스테롤 축적을 촉진할 수 있음이 보고되었으므로, 이러한 상황에서의 콜레스테롤 축적이 유발하는 세포 내 변화를 규명하는 것은 잠재적 치료 표적을 탐색하는 데 도움이 될 수 있다. 본 연구에서 콜레스테롤 축적은 미토파지 저해 및 인플라마좀 반응의 활성화와 연관되어 나타났으며, 이는 콜레스테롤 과부하 조건에서 변화하는 미토콘드리아 항상성 및 인플라마좀 신호가 향후 치료적 개입 지점으로 고려될 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The brain contains approximately 23% of the body’s total cholesterol and is important in maintaining neuronal function. Dysregulation of cholesterol homeostasis in the brain was reported in previous studies due to increased permeability in blood brain barrier induced by high cholesterol diet. Because neurons have high energetic demands, mitochondria are critical for neuronal function. Mitochondrial dysfunction elicits adaptive responses to maintain mitochondrial homeostasis, such as mitochondrial biogenesis and mitophagy. In addition, mitochondrial dysfunction can also lead to mitochondrial DNA increase in the cytosol, released from mitochondria, which acts as a signal for inflammasome activation. Previous studies report that excess free cholesterol destabilizes mitochondrial function, lowering mitochondrial membrane potential and increasing oxidative stress. Also, in an Alzheimer’s disease transgenic mouse model with sterol regulatory element–binding transcription factor 2 (SREBP-2) upregulation, mitophagy disruption was reported due to defective recruitment of optineurin, a key autophagy receptor. Therefore, we aimed to determine the effect of cholesterol-induced mitochondrial stress on mitophagy and inflammasome activation in neuronal cells under hypercholesterolemia conditions in SH-SY5Y cells. SH-SY5Y human neuroblastoma cells were incubated with 25 or 50 µg/mL water-soluble cholesterol in the culture media for 24 h. Intracellular total cholesterol was measured by the colorimetric method, and cell viability was measured by the trypan blue assay. DNA damage was assessed by the comet assay, and mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species generation were measured by fluorescence assay. And ATP production was measured by luminescence assay. The relative protein levels, mRNA level and DNA levels were analyzed by Western blotting, RT-qPCR, and PCR analysis, respectively. Cholesterol loading elevated intracellular cholesterol by up to 1.7-fold in 50 µg/mL cholesterol. Apoptotic bodies and a decrease in viability were observed in cholesterol-treated cells. In addition, DNA damage increased in cholesterol-treated cells, and an increase in phosphorylation of the Tau protein was observed in 50 µg/mL cholesterol-treated cells, indicating cell damage and neuronal degeneration. Apoptosis was also observed, with increased mRNA level of CHOP and protein level of cleaved caspase-3 after 50 µg/mL cholesterol treatment in SH-SY5Y cells. An increase in cleaved caspase-9 levels suggests activation of the mitochondrial apoptotic pathway, which is further supported by the decreased mitochondrial membrane potential observed in 50 µg/mL cholesterol treatment. Increased generation of reactive oxygen species and decreased ATP production were observed in 50 µg/mL cholesterol-treated cells, indicating mitochondrial dysfunction. Cholesterol 50 µg/mL treatment increased mitochondrial biogenesis as determined by increased mRNA level of PPARGC1A, but decreased total mitochondrial DNA copy number. Cholesterol loading activated the initiation of mitophagy, which was confirmed by increased levels of PTEN-induced putative kinase 1, Parkin, and phospho-ubiquitin in the mitochondrial fraction. However, increases in microtubule-associated protein light chain 3B -II and p62 showed the possibility of blockage of autophagosome degradation. This flux blockade was confirmed by calculating autophagy flux after treating with chloroquine, an autophagy inhibitor. Cytosolic mitochondrial DNA copy number was increased after 50 µg/mL cholesterol treatment, indicating increased accumulation of mitochondrial DNA in the cytosolic fraction, which was released from mitochondria. In addition, the mRNA level of CASP1 and Interleukin 1 beta secretion was increased, suggesting inflammasome-associated inflammatory signaling. Taken together, these findings indicate that cholesterol accumulation induces cytotoxicity in SH-SY5Y cells, accompanied by mitochondrial dysfunction and altered mitochondrial homeostasis. Cholesterol activates mitophagy but fails to complete mitochondrial clearance due to impaired autophagy flux, which may contribute to the persistence of damaged mitochondria. Mitochondrial stress is associated with increased cytosolic mtDNA and interleukin 1 beta secretion and may contribute to mitochondria-mediated apoptosis. Given that hypercholesterolemia has been reported to promote cholesterol accumulation, investigating the cellular consequences of cholesterol accumulation under this condition may help identify potential therapeutic targets. In our study, cholesterol accumulation was associated with defective mitophagy and inflammasome responses, suggesting that mitochondrial homeostasis and inflammasome signaling that change under cholesterol overload may be potential points of intervention.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Contents iv
• List of Table vi
• List of Figures vii
• List of Abbreviations viii
• Ⅰ. Introduction 1
• 1. Brain cholesterol metabolism and disruption of cholesterol homeostasis in diseases 1
• 2. Mitochondrial homeostasis disruption in neurodegenerative diseases 5
• 3. Mitochondrial dysfunction and inflammasome 8
• 4. Aims of the study 10
• Ⅱ. Materials and Methods 11
• 1. Cell culture 11
• 2. Cholesterol preparation and treatment 11
• 3. Total cholesterol mass quantification and filipin staining 12
• 4. Cell viability assay and DAPI staining 13
• 5. Single cell gel electrophoresis (Comet assay) 14
• 6. Detection of reactive oxygen species generation and ATP assay 15
• 7. Mitochondrial membrane potential assay 16
• 8. Western blotting 17
• 9. Measurement of gene expression using semiquantitative and quantitative PCR analysis 19
• 10. Genomic and cytosolic DNA extraction and qPCR-based mtDNA quantification 20
• 11. Enzyme-linked immunosorbent assay 21
• 12. Statistical analysis 22
• Ⅲ. Results 23
• 1. Incubation with cholesterol increases cellular cholesterol content in SH-SY5Y cells 23
• 2. Cholesterol overloading decreased cell viability 25
• 3. Cholesterol overloading induced DNA damage and neuronal degeneration in SH-SY5Y cells 27
• 4. Cholesterol overloading induced apoptosis in SH-SY5Y cells 29
• 5. Cholesterol overloading increased mitochondrial damage in SH-SY5Y cells 31
• 6. Cholesterol overloading alters mitochondrial biogenesis and reduces mitochondrial content in SH-SY5Y cells 33
• 7. Cholesterol overloading induced mitophagy in SH-SY5Y cells 35
• 8. Cholesterol overloading decreased autophagy flux in SH-SY5Y cells 37
• 9. Cholesterol overloading induced inflammasome activation in SH-SY5Y cells 39
• Ⅳ. Discussion 41
• Ⅴ. References 47
• 국 문 초 록 55