Discovery and Biological Evaluation of Selective and Dual-Acting Adenosine Receptor Ligands = 선택적 및 이중 작용 아데노신 수용체 리간드의 발굴과 생물학적 특성 평가

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part 1: Discovery and biological evaluation of a novel template, N3-1′ homologated 4′-truncated thiosugar-substituted xanthine as an A3AR antagonist
Adenosine receptors (ARs) are G protein-coupled receptors involved in diverse physiological and pathological processes. Among them, the A3 subtype (A3AR) has emerged as an attractive therapeutic target due to its low basal expression and strong upregulation in inflamed or tumor tissues. In this study, an A1AR–derived xanthine scaffold was repurposed toward A3AR antagonism by introducing a 1′–homologated, 4′–truncated thiosugar at the N3 position, which afforded the first xanthine-based analog demonstrating measurable affinity toward adenosine receptors. Structure–activity relationship studies further revealed that C8 substitution is the primary determinant of subtype selectivity, while N1 substituents cooperatively modulate receptor preference.
The optimized analogue 5p exhibited potent and selective A3AR binding (Kᵢ = 6.8 nM) with clear functional antagonism, and showed a markedly improved A1/A3 selectivity index of 72, compared with 4.5 for the known xanthine-based A3AR antagonist I-ABOPX (Kᵢ for A3AR = 15 nM). These results demonstrate that thiosugar homologation effectively redirects xanthine scaffolds toward selective A3AR antagonists and identify 5p as a promising lead compound.
To elucidate the predicted binding mode of compound 5p, molecular docking studies were performed using the recently reported A3AR antagonist–bound crystal structure (LUF7602, PDB 9EHS). Glide docking indicated that 5p adopts a binding pose highly similar to that of LUF7602 within the orthosteric pocket, sharing key interactions including π–π stacking with Phe168 and hydrogen bonding with Asn250.
Notably, the thiosugar moiety of 5p formed an additional hydrogen bond with Tyr15, which is expected to further enhance binding stability.
Collectively, these findings highlight N3 thiosugar homologation and C8/N1 diversification as effective strategies to reprogram xanthine scaffolds toward A3AR antagonism and establish 5p as a compelling lead for future therapeutic development.

Part 2: Design, Synthesis, and Biological Evaluation of C2–(N–Substituted Amino) Truncated 4′–Thioadenosine Derivatives as A2AAR and A3AR Dual Ligands
Dual modulation of adenosine A2A and A3 receptors (ARs) has emerged as a promising therapeutic strategy in conditions driven by receptor interplay. Although C2 NH–linkers are known in nucleoside-based A2A agonists, their integration with a truncated thiosugar scaffold is unprecedented and offers structural novelty. The cross–reactivity of the A2A agonist CGS21680 at A3AR further motivated a structural assessment of dual binding. Docking analyses revealed that CGS21680 retains conserved purine interactions in both receptors, while its C2–NH linker adopts receptor-specific orientations reflecting distinct pocket geometries. These insights suggested that flexible C2 NH–linker substituents could simultaneously access divergent subpockets, with substituent size and spatial orientation shaping dual selectivity.
Guided by this hypothesis, a panel of C2-modified truncated 4′–thioadenosines was synthesized. Structure–activity relationship studies showed that aryl amine analogues exhibited measurable affinity for both A2A and A3 ARs, whereas aliphatic analogues were inactive. Within the aryl series, ortho substitution consistently enhanced binding affinity relative to meta or para substitution. Among these, compound 4q (ortho–morpholinophenyl) demonstrated high dual affinity (hA2AAR Kᵢ = 15.0 ± 1.2 nM; hA3AR Kᵢ = 4.5 ± 0.5 nM). Computational modeling supported orthosteric binding at both receptors, while cAMP assays revealed functional inverse agonism at hA2AAR (−19%) and antagonism at hA3AR (69% inhibition of the NECA response).
Collectively, these findings demonstrate that C2–NH–R substitution on a truncated 4′–thioadenosine scaffold provides a compact and versatile platform for dual A2A/A3AR engagement, and highlight 4q as a promising dual ligand with potential to guide future adenosine receptor ligand development.

국문 초록 (Abstract)

파트 1: 새로운 템플릿인 N3–1′ 연장된 4′–절단된 티오슈거 치환 잔틴계 A3AR 길항제의 발굴 및 생물학적 평가 아데노신 수용체는 다양한 생리적·병리적 과정에 관여하는 G 단백질
연결 수용체군에 속함. 이 중 A3 아형은 정상 조직에서의 낮은 발현
수준과 염증 또는 종양 조직에서의 뚜렷한 발현 증가로 인해 매력적인
치료 표적으로 주목받고 있음. 본 연구에서는 A1AR 리간드로 알려진
잔틴골격을 기반으로, N3 위치에 1′-연장되고 4′-절단된 티오슈거를
도입하여 A3AR 길항제 효과를 갖도록 구조적 재설계를 수행하였음. 이를 통해 아데노신 수용체에 대해 측정 가능한 결합 친화도를 처음으로
나타내는 잔틴 기반 유도체를 확보하였음. 구조–활성 관계 분석 결과, C8 위치의 치환기가 아형 선택성을 결정하는 주요 요소임이 밝혀졌으며, N1 치환기는 수용체 선호성을 보조적으로 조절하는 것으로 나타났음. 최적화된 유도체 5p는 A3AR에 대해 Kᵢ = 6.8 nM의 높은 결합
친화도와 명확한 기능적 길항 효과를 보였으며, 기존의 잔틴계 A3AR
길항제인 I-ABOPX(Kᵢ = 15 nM) 대비 A1/A3 선택성 지수(selectivity
index) 가 4.5에서 72로 크게 향상되었음. 이러한 결과는 티오슈거의
homologation 전략이 잔틴 골격을 선택적 A3AR 길항제로 전환시키는
효과적인 접근임을 보여주며, 5p가 유망한 리드 화합물임을 시사함. 화합물 5p의 예상 결합 양상을 규명하기 위해, 최근 보고된 A3AR
길항제(LUF7602) 결합 결정 구조(PDB 9EHS)를 기반으로 분자 도킹
연구를 수행하였음. Glide 도킹 결과, 5p는 정위성 결합
부위(orthosteric pocket)에서 LUF7602와 매우 유사한 결합 자세를
나타냈으며, Phe168과의 π–π 상호작용, Asn250과의 수소 결합 등
핵심 상호작용을 공유하는 것으로 나타났음. 특히 5p의 티오슈거 부분이
Tyr15와 추가적인 수소 결합을 형성하는 것으로 예측되어, 이는 결합
안정성 향상에 기여할 수 있을 것으로 판단됨. 종합적으로, 본 연구는 N3 위치의 티오슈거 homologation 및 C8/N1
치환체 다변화가 잔틴 기반 골격을 A3AR 선택적 길항제로 재설계하는
효과적인 전략임을 입증하며, 5p가 향후 치료제 개발을 위한 유망한
후보임을 제시함.

Part 2: C2–(N-치환 아미노) 치환된 절단형 4′-티오아데노신 유도체의 A2AAR 및 A3AR 이중 작용 리간드 연구: 설계, 합성 및 생물학적 평가 아데노신 A2A 및 A3 수용체를 동시에 조절하는 전략은 두 수용체
간의 상호작용이 병태생리에 관여하는 다양한 질환에서 유망한 치료적
접근법으로 부상하고 있음. 기존 연구에서 뉴클레오사이드 기반 A2A
작용제에는 C2 NH-링커가 보고되어 있으나, 이를 절단형 티오슈거
골격과 결합한 사례는 없으며, 이러한 조합은 구조적 참신성을 제공함. 또한 A2A 작용제 CGS21680이 A3AR에서도 교차 활성을 보인다는
점은 이중 결합 가능성에 대한 구조적 탐색의 필요성을 더욱 부각시켰음. 도킹 분석 결과, CGS21680은 두 수용체에서 모두 퓨린핵심의 보존된
상호작용을 유지하였으나, C2–NH 링커는 각 수용체의 포켓 구조적
차이를 반영하여 서로 다른 방향성을 취하는 것으로 나타났음. 이러한
결과는 유연한 C2 NH-링커 치환체가 각기 다른 서브포켓에 동시에
접근할 수 있으며, 치환기의 크기와 공간적 배향이 이중 선택성에
중요한 역할을 할 것임을 시사하였음. 이러한 가설을 바탕으로, C2 위치를 변형한 절단형 4′-티오아데노신
유도체 라이브러리를 합성하였음. 구조–활성 관계 분석 결과, 아릴 아민
유도체는 A2AAR 및 A3AR 모두에 대해 측정 가능한 친화도를 보인
반면, 지방족 아민 유도체는 활성이 없는 것으로 확인되었음. 아릴 계열
내에서는 오르토(ortho) 치환이 메타(meta) 또는 파라(para) 치환보다
일관되게 더 높은 결합 친화도를 나타냈음. 그 중에서도 4q
화합물(ortho-morpholinophenyl 치환체)은 hA2AAR Kᵢ = 15.0 ± 1.2
nM, hA3AR Kᵢ = 4.5 ± 0.5 nM으로 높은 수준의 이중 결합력을 보였음. 분자 도킹 모델링은 이 화합물이 두 수용체의 정위성(orthosteric)
결합 부위에 결합함을 지지하였으며, cAMP 기능 분석 결과
hA2AAR에서는 −19%의 역작용제 활동, hA3AR에서는 NECA 반응의
69% 길항 효과가 관찰되었음. 종합적으로, 본 연구는 절단형 4′-티오아데노신 골격의 C2 위치에
NH-R 치환체를 도입하는 전략이 A2AAR/A3AR 이중 타깃 리간드
개발에 적합한 플랫폼을 제공함을 보여주며, 4q 화합물이 향후 아데노신
수용체 리간드 설계를 이끌 수 있는 유망한 이중 작용 후보임을 제시함.

목차 (Table of Contents)

• Part 1. Discovery and biological evaluation of a novel template, N3–1′ homologated 4′–truncated thiosugar–substituted xanthine as an A3AR antagonist 1
• Chapter1. Introduction 2
• Chapter2. Results and Discussion 5
• i. Chemical synthesis 5
• ii. Biological evaluation 8
• iii. Computational study 12
• Chapter3. Conclusion 17
• Chapter4. Experimental Section 18
• i. Experimental procedures and resulting material characterization 18
• ii. Experimental procedures for biological evaluation 40
• iii. Molecular modeling 43
• Bibliography 44
• Part 2: Design, synthesis, and biological evaluation of C2-(N-Substituted Amino) truncated 4′-thioadenosine derivatives as A2AAR and A3AR dual ligands 48
• Chapter1. Introduction 49
• Chapter2. Results and Discussion 52
• i. Chemical synthesis 52
• ii. Biological evaluation 53
• iii. Computational study 56
• Chapter3. Conclusion 60
• Chapter4. Experimental Section 61
• i. Experimental procedures and resulting material Characterization 62
• ii. Experimental procedures for biological evaluation 69
• iii. Molecular modeling 73
• Bibliography 75
• Abstract in Korean 79