Development of region-specific in vivo hypermutation tool = 부위 특이적 생체 내 돌연변이 유도 도구의 개발

국문 초록 (Abstract)

자연의 단백질 진화과정은 세포 내 특정 DNA에 표적화된 돌연변이를 유도하여 서열 다양화가 가속화를 만들어내고 그를 통해 생체분자의 기능 향상을 지속적으로 만들어낸다. 항체의 성숙 과정에서 보체결정영역(CDR)에 체세포 돌연변이가 집중되는 현상이 대표적이다. 따라서 기능적으로 핵심적인 유전자 내부 구간에 돌연변이를 집중시킬 수 있도록 편집 범위를 사용자가 자유자재로 조절할 수 있는 공학적 전략은 단백질 연속적 유도 진화의 활용 폭을 넓히는 데 중요하지만, 이러한 특성을 모두 갖춘 분자 도구는 아직 드물다. 본 연구에서는 유전자 표적에서 경계가 명확한 약 200 bp 범위의 집중적 다양화를 구현하는 RESPECTevo를 제시한다. 대장균(Escherichia coli)의 type I-E Cascade 복합체가 지니는 표적 특이성, spacer 길이의 가변성, 그리고 불일치 허용도를 활용함으로써, RESPECTevo는 연속적 부위 특이적 돌연변이, 표적 범위의 자유로운 조절, 그리고 동시에 두 부위 이상의 표적 돌연변이가 가능하다. 종합하면, RESPECTevo는 세포 내에서 연구자가 원하는 구간의 유전자를 정밀하게 다양화하여 단백질의 연속적 진화를 촉진하는 효율적 플랫폼으로서, 응용 생명공학의 발전에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Targeted hypermutation within cells accelerates diversification of defined DNA segments, supporting ongoing improvement of proteins and other biomolecules. Biology offers a clear precedent in antibody affinity maturation, where somatic changes concentrate in the CDRs. An engineered approach that confines mutagenesis to user-selected, functionally crucial intragenic zones—and lets the edited span be tuned—would broaden utility, yet such tools remain uncommon. We introduce RESPECTevo, which delivers sharply bounded diversification within endogenous or introduced targets up to about 200 base pairs. By exploiting the specificity, spacer-length tunability, and mismatch tolerance of the type I-E Cascade complex, RESPECTevo achieves precise locus-restricted hypermutation, adjustable targeting breadth, and sustained diversification at two distinct loci. Overall, RESPECTevo provides an effective route to drive continuous protein evolution by diversifying researcher-defined regions in cellular contexts for biotechnology.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• Chapter 2. Results 4
• 2.1. Cas12a-Cas9 fusion guide RNA strategy 4
• 2.2. Concetpt test of Cascade-deaminase fusion 6
• 2.3. Optimization process on RESPECTevo 9
• 2.4. Estimating limit length of spacer 11
• 2.5. Continuous hypermutation after mistmatch generation 13
• 2.6. Simultaneous targeting capability in genomic region 14
• 2.7. Off-target effect 16
• 2.8. Evolution of ecDHFR-TMP inhibiting interface 17
• Chapter 3. Discussion 19
• Chapter 4. Materials and Methods 22
• 4.1. General materials 22
• 4.2. Media and antibiotics 22
• 4.3. Plasmid construction 23
• 4.4. In vivo hypermutation 25
• 4.5. PCP suppression assay 26
• 4.6. Cas3 interference assay 26
• 4.7. Rifampicin resistance assay 27
• 4.8. crRNA cloning 28
• 4.9. ecDHFR selection under trimethoprim 28
• 4.10. Growth assays and IC₅₀ determination 30
• 4.11. Mutation frequency calculation 31
• 4.12. Sample preparation for high-throughput sequencing 31
• 4.13. Processing and analysis of sequencing data 33
• 4.14. Statistics 34
• References 36
• Abstract in Korean 42