Development of a chicken immunoglobulin heavy chain variable region (VH) single domain antibody (sdAb) against calsequestrin (CSQ) and its application = Calsequestrin (CSQ)을 표적으로 하는 닭 유래 면역글로불린 heavy chain variable region(VH) 단일 도메인항체(sdAb)의 개발 및 그 응용

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Calsequestrin (CSQ) is a calcium-binding protein that is highly soluble and has potential as a solubility-enhancing fusion tag in recombinant protein expression. Furthermore, it enables robust purification through calcium-induced precipitation followed by resolubilization by chelating agents such as EDTA. Despite these advantages in protein expression and purification, the application of CSQ-tagged proteins in research, including immunoassays and cell-based analyses, has been limited by the lack of dependable anti-CSQ detection reagents. In this study, we selected single-domain antibodies (sdAbs) against CSQ from a phage-displayed chicken VH libraries generated from CSQ-immunized chickens. After biopanning, CSQ-specific VH sdAb clones were isolated and expressed as VH human kappa light chain constant region (VH-Cκ) fusion proteins in E. coli. Among them, the PE06 clone was selected for further studies. Following conjugation to HRP and Alexa Fluor 647 fluorescent dye, PE06 VH-Cκ fusion protein was successfully applied to enzyme-linked immunosorbent assay, immunoblot, and flow cytometry analyses to detect CSQ-tagged sdAbs expressed in E. coli. Our study opens the possibility for chemically defined antibodies to be expressed as recombinant antibodies fused with CSQ, such as scFv-CSQ fusion proteins, and applied to various research applications.

국문 초록 (Abstract)

칼세퀘스트린(Calsequestrin, CSQ)은 칼슘 결합 단백질로서, 높은 용해도를 지녀 재조합 단백질의 발현 효율을 높이는 융합 태그(fusion tag)로 활용될 수 있다. 또한, 칼슘 농도에 따라 쉽게 침전되고, EDTA 등의 킬레이트제를 통해 다시 용해시킬 수 있어 단백질 정제가 간편하다는 장점을 가진다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고, CSQ 태그 단백질을 연구나 분석에 활용한 사례는 매우 제한적이었다. 이는 CSQ를 안정적으로 인식할 수 있는 신뢰성 높은 항체 시약이 부족했기 때문이다.

본 연구에서는 CSQ로 면역화한 닭으로부터 제작한 파지 디스플레이 단일도메인 항체(single-domain antibody, sdAb) 라이브러리를 이용하여 CSQ 특이적 항체를 선별하였다. 바이오패닝을 통해 얻은 VH sdAb 클론들을 인간 카파 경쇄 상수영역(VH–Cκ)과 융합 형태로 대장균에서 발현하였으며, 그중 PE06 클론을 대표로 선정하여 특성 분석을 수행하였다.

HRP 또는 Alexa Fluor 647 형광염료로 표지한 PE06 VH–Cκ 단백질은 ELISA, immunoblot, flow cytometry 등 다양한 면역분석에서 CSQ 태그 단백질을 효과적으로 검출하였다. 이러한 결과는 CSQ 융합 단백질(scFv–CSQ 등)을 이용한 재조합 단백질의 발현 및 검출에 있어, CSQ 태그 시스템이 연구 전반에 걸쳐 안정적이고 재현성 높은 도구로 활용될 수 있음을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract 1
• Table of Contents 3
• List of Tables 4
• List of Figures 5
• List of abbreviations 7
• Introduction 9
• Purpose of the Study 22
• Materials and Methods 23
• Results 44
• Discussion 71
• Conclusions 79
• References 81
• Abstract in Korean (초 록) 85