Comprehensive Multi-Layer Proteomic Analysis of Enterotoxigenic and Nontoxigenic Bacteroides fragilis = 독소 생성형 및 비독소형 Bacteroides fragilis에 대한 다층적 단백체 비교 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Bacteroides fragilis (B. fragilis) is a gram-negative anaerobe that constitutes approximately two percent of the human colonic microbiota and exists as enterotoxigenic (ETBF) and non-toxigenic (NTBF) strains. ETBF secretes the metalloprotease B. fragilis toxin (BFT), a virulence factor linked to diarrheal disease, inflammatory bowel disease, and colorectal cancer, whereas NTBF lacks this determinant. Despite their clinical relevance, proteomic comparison between the two strains remains limited. To address this gap, we construct an in-silico protein database integrating ETBF and NTBF sequences, and generated spectral libraries for the global proteome, secretome, and phosphoproteome. The spectral library encompassed 3,696 proteins and 68,357 peptides, providing as a comprehensive resource for downstream analyses. Data-independent acquisition (DIA) across biological replicates enabled consistent identification of proteome features, including annotated phosphorylation sites. Global proteome analysis quantified 2,956 protein groups, with 269 proteins upregulated and 249 downregulated in ETBF. Secretome profiling identified 1,369 protein groups of which ~36% were predicted to be secreted or membrane proteins. Phosphoproteome analysis detected 292 sites on 148 proteins, including 5 sites enriched and 3 reduced in ETBF relative to NTBF. This study presents the first integrated, multi-layer proteomic dataset of B. fragilis. ETBF was characterized by pathogenic signatures, including BFT-mediated processes and Type VI Secretion System (T6SS) components, whereas NTBF exhibited metabolic resilience. Beyond the cataloging of strain-specific features, this dataset provides a foundation for mechanistic studies on host-microbe interactions, phosphorylation-mediated regulation, and translational applications. Importantly, by associating ETBF-specific molecular programs with chronic inflammation and colorectal carcinogenesis, the findings establish a resource that advances cancer biology and facilitates the identification of biomarkers and therapeutic targets.

국문 초록 (Abstract)

Bacteroides fragilis (B.fragilis)는 사람 대장 미생물총의 약 2%를 차지하는 그람 음성 혐기성 세균으로, 독소 생성 균주(ETBF)와 비독소 생성 균주(NTBF)로 구분된다. ETBF는 메탈로프로테아제 독소인 B. fragilis toxin(BFT)을 분비하며, 이는 설사, 염증성 장 질환, 대장암과 연관된 병원성 인자로 알려져 있다. 반면, NTBF는 해당 유전자를 보유하지 않는다. 임상적 중요성에도 불구하고, 두 균주 간의 단백체 비교 연구는 아직 제한적이다. 본 연구에서는 이러한 공백을 메우기 위해 ETBF와 NTBF의 단백질 서열을 통합한 in-silico 단백질 데이터베이스를 구축하고, 전체 단백체, 분비 단백체, 인산화 단백체를 아우르는 스펙트럴 라이브러리를 제작하였다. 이 라이브러리는 총 3,696개의 단백질과 68,357개의 펩타이드를 포함하여 후속 분석을 위한 포괄적 자원을 제공한다. 또한 개별 샘플들을 대상으로 데이터 독립적 획득법(DIA)을 통해 생물학적 반복간 일관된 단백질 동정을 확보하였으며, 인산화 부위까지 안정적으로 확인할 수 있었다. 그 결과, 전체 단백체 분석에서는 2,956개의 단백질군이 정량 되었고, ETBF에서 269개 단백질이 발현 증가, 249개 단백질의 발현이 감소하였다. 분비 단백체 분석에서는 1,369개의 단백질군이 확인되었으며, 이 중 약 36%는 분비 단백질 또는 막 단백질로 예측되었다. 인산화 단백체 분석에서는 148개 단백질에서 292개의 인산화 부위가 확인되었고, 이 중 5개 부위는 ETBF에서 증가하고 3개 부위는 감소하였다. 본 연구는 B. fragilis의 최초 통합 다층 단백체 데이터셋을 제시하며, ETBF에서는 BFT 매개 과정 및 Type VI 분비 시스템과 같은 병원성 신호가, NTBF에서는 대사적 회복력이 두드러지게 나타남을 확인하였다. 이러한 균주 특이적 분자 전략의 비교는 숙주-미생물 상호작용, 인산화 기반 조절 기전, 그리고 전임상적 응용 연구를 위한 기반을 제공한다. 특히 ETBF의 분자 프로그램을 만성 대장염과 염증성 대장암 발병과 연관시킴으로써, 본 연구는 종양 생물학적 이해를 확장하고 잠재적 바이오마커 및 치료 표적 발굴을 위한 자원을 마련한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1 Study background 1
• 1.2 Purpose of research 7
• Chapter 2. Materials and Methods 9
• 2.1 Bacterial culture 11
• 2.2 Sample preparation - Bacterial pellets 11
• 2.3 Sample preparation - Conditioned media 11
• 2.4 Offline high pH reversed-phase peptide fractionation 13
• 2.5 LC-MS/MS analysis 16
• 2.6 Data processing - In-silico database 17
• 2.7 Data processing - Spectral library generation 17
• 2.8 Data processing - DIA data analysis 18
• 2.9 Statistical analysis and bioinformatics analysis 18
• Chapter 3. Results 20
• 3.1 Construction of an in-silico database as a foundation for multi-layer proteomic analyses 20
• 3.2 Establishment of spectral libraries for multi-layer proteome profiling of Bacteroides fragilis 22
• 3.3 DIA-based analysis of individual samples 26
• 3.4 Comparative analysis of the global proteome between ETBF and NTBF 29
• 3.5 Comparative analysis of the secretome between ETBF and NTBF 37
• 3.6 Comparative analysis of the phosphoproteome between ETBF and NTBF 49
• 3.7 Virulence-associated proteins of the ETBF pathogenicity island 54
• 3.8 Expression patterns of T6SS-related proteins in the global proteome and secretome of ETBF and NTBF 56
• 3.9 Prediction of localization and secretion pathways for upregulated proteins in ETBF and NTBF 60
• 3.10 Functional classification of upregulated proteins in ETBF and NTBF 64
• 3.11 Functional GO annotation of ETBF and NTBF proteomes 67
• 3.12 Comparative analysis of the phosphoproteome between ETBF and NTBF 71
• 3.13 Expression characteristics of shared proteins across the global, secretome, and phosphoproteome layers 80
• 3.14 CRC-related virulence factor candidate profiling in ETBF 85
• Chapter 4. Discussion 88
• Chapter 5. Conclusion 102
• Bibliography 103
• Abstract in Korean 115