Auranofin Induces Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Apoptosis, and Combination with Bortezomib Elicits Paraptosis-Like Cell Death in Canine Mammary Tumor Cells = 개 유선 종양 세포에서 오라노핀에 의한 소포체 스트레스 매개 세포자멸사 유도 및 보르테조밉과 병용에 의한 파라프토시스 유사 세포사 유발

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Canine mammary tumors (CMT) are common in female dogs, often associated with malignancy and limited responses to conventional therapies. This study explores the potential of Auranofin (AF) in malignant CMT, focusing on its ability to induce distinct cell deaths. AF inhibited thioredoxin reductase (TrxR) activity, cell proliferation, and colony formation across malignant CMT cell lines, demonstrating significant anticancer effects. In AF-sensitive cell lines (CMT-U27, CHMm, and CHMp), 0.5–2 µM AF induced endoplasmic reticulum (ER) stress-mediated apoptosis, while concentrations above 3 µM caused near-complete cell death via additional proteasome inhibition. However, in AF-resistant cell lines (CIPp and CIPm), AF concentrations required for near-complete cell death were higher, expected to be challenging to achieve clinically. Therefore, I combined sublethal doses of AF (~2 µM) with the proteasome inhibitor Bortezomib (Bz) in these cells. The combination exhibited synergistic cytotoxicity and induced extensive cytoplasmic vacuolation. Live-cell staining revealed the ER origin of vacuoles, and cycloheximide pretreatment inhibited both vacuolation and AF + Bz-induced cell death, indicating features of paraptosis. While apoptosis could not be excluded, it was classified as paraptosis-like cell death occurring concurrently with apoptosis. Further analysis supported that this cell death is related to enhanced ER stress from AF-induced TrxR inhibition and Bz-induced proteasome inhibition. Based on these findings, this study proposes AF alone or combined with Bz as a promising therapeutic strategy for malignant CMT. These results highlight AF’s potential to induce ER stress-mediated apoptosis and paraptosis-like cell death in canine cancer cells, expanding therapeutic options for targeting cancers in dogs.

국문 초록 (Abstract)

개 유선 종양 (Canine Mammary Tumor, CMT)은 암컷 개에서 흔히 발생하며, 종종 높은 악성도를 보이고 기존 치료에 제한적인 반응을 나타낸다. 본 연구는 악성 CMT에 대한 오라노핀의 항암효과를 조사하면서, 다양한 세포사 유형을 유도하는 오라노핀의 특성에 주목하였다. 오라노핀은 악성 CMT 세포주에서 티오레독신 환원효소 (Thioredoxin Reductase, TrxR)의 활성을 억제하였고, 세포 증식 및 콜로니 형성을 감소시키는 등 유의미한 항암 효과를 보였다. 오라노핀에 민감한 세포주 (CMT-U27, CHMm, CHMp)에서는 0.5–2 µM 오라노핀이 소포체 스트레스 매개 세포자멸사를 유도하였으며, 3 µM 이상의 농도에서는 추가적인 프로테아좀 억제를 통해 거의 완전한 세포사를 유발하였다. 반면, 오라노핀에 저항성을 보이는 세포주 (CIPp, CIPm)에서 거의 완전한 세포사를 유발하려면 혈중에서는 달성하기 어려울 것으로 예상되는 고농도의 오라노핀이 필요하였다. 따라서 보다 효과적인 항암효과를 달성하기 위해, 민감한 세포주에서 확인된 고농도 오라노핀의 작용을 모방하고자 약독성 농도(~2 µM)의 오라노핀을 프로테아좀 억제제인 보르테조밉과 병용하였다. 병용 처리는 상승적인 세포 독성을 나타냈으며, 세포질 내에 소포체에서 유래한 다량의 공포를 유도하였다. 시클로헥시미드 전처리는 세포질 내 공포의 생성을 완전히 억제하였으며, 세포독성을 부분적으로 억제하였다. 이러한 결과는 오라노핀과 보르테조밉의 병용에 의해 유도된 세포사가 파라프토시스와 관련이 있음을 시사한다. 다만 세포자멸사를 배제할 수 없었기에, 이를 세포자멸사와 동시에 발생하는 파라프토시스 유사 세포사로 구분하였다. 한편, 오라노핀과 보르테조밉의 병용은 오라노핀에 의한 TrxR 억제와 보르테조밉에 의한 프로테아좀 억제로 인해 증가된 소포체 스트레스를 보였다. 본 연구는 오라노핀 단독 및 보르테조밉과의 병용이 악성 CMT 치료에서 효과적인 전략이 될 가능성을 제시하며, 오라노핀이 소포체 스트레스 매개 세포자멸사 및 파라프토시스 유사 세포사를 유도함으로써 개의 종양에 대한 새로운 치료 옵션을 제공할 수 있음을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents iii
• List of Figures v
• List of Tables vii
• Abbreviations viii
• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 4
• 2.1. Cell culture and cell line authentication statement 4
• 2.2. Drugs and treatment 4
• 2.3. Cell viability assay 5
• 2.4. Clonogenic assay 6
• 2.5. Protein extraction 6
• 2.6. TrxR activity assay 7
• 2.7. Western blot analysis 7
• 2.8. Drug synergism analysis 8
• 2.9. Live-cell staining of the ER and nucleus 8
• 2.10. Statistical analysis 9
• 3. Results 10
• 3.1. AF inhibits proliferation, colony formation and TrxR activity in CMT cells 10
• 3.2. AF induces ER stress, proteasome inhibition, and apoptosis in AF-sensitive CMT cells 11
• 3.3. Combination of sub-lethal doses of AF and Bz exhibits synergistic cytotoxicity in AF-resistant CMT cells 12
• 3.4. Combination of AF and Bz induces paraptosis-like cell death in AF-resistant CMT cells 13
• 3.5. AF + Bz induces paraptosis-like cell death via TrxR inhibition, proteasome inhibition, and ER stress 14
• 4. Discussion 16
• 5. Figures and Tables 23
• References 42
• Appendix 49
• 국 문 초 록 50