Accounting for Pathogen-Derived mRNA Reveals β-actin as a More Stable Reference Gene Than GAPDH During Toxoplasma gondii Infection = 세포내 진핵 병원체인 T. gondii 감염에서 참조 유전자로서 GAPDH와 β-actin의 안정성 비교

국문 초록 (Abstract)

Toxoplasma gondii (T. gondii)는 세포내 편성기생충으로서 이는 숙주세포의 대사와 유전자 발현 등을 변화시키는 것으로 알려져 있다. T. gondii가 유발하는 이러한 변화들은 숙주의 전사체 연구에서 정규화 과정에 사용되는 하우스키핑 유전자의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는, T. gondii에 감염된 human foreskin fibroblast에서 널리 사용되는 하우스키핑 유전자인 GAPDH와 ACTB의 발현 안정성을 분석하였다. 면역세포화학법과 역전사 중합효소 연쇄반응법 (RT-qPCR)은 이 두 유전자의 단백질 발현과 전사체 발현 간의 경향성 차이를 보여주었으며, ACTB의 전사체 발현량이 감염 다중도가 증가함에 따라 감소함을 보여주었다. 이러한 현상의 원인을 T. gondii를 감염시켰을 때의 기생충의 전사체가 전체 전사체에서 일정 비율을 차지하기 때문인 것으로 추정하여, 전체 전사체에서 T. gondii로부터 유래된 전사체 비율을 측정한 결과, 감염 다중도가 10인 경우 전체 전사체에서 30%를 차지한 것으로 측정되었다. 이는 기생충으로부터 유래된 유전물질이 정량적 중합효소 연쇄반응의 재료인 cDNA 수준에서 상당한 비율을 차지하며, 따라서 숙주세포의 유전자 발현을 분석할 때 편향을 일으킬 수 있음을 시사한다. 이를 보정하기 위하여 RT-qPCR 데이터를 재조정한 결과, ACTB는 감염 다중도와 무관하게 일정한 발현량을 유지하였으며, GAPDH는 다소 증가한 경향성을 보였다. 이러한 결과는 ACTB가 T. gondii 감염 시 GAPDH보다 더 안정적인 참조 유전자로서의 역할을 수행함을 보여주며 진핵생물 도메인에 속하는 세포내 기생충을 감염 시, 숙주세포의 전사체 데이터를 해석할 때 기생충으로부터 유래된 전사체를 고려하는 점의 중요성을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan that profoundly alters host cell metabolism and gene expression. Such alterations may affect the stability of housekeeping genes of the host which is commonly used for normalization in transcriptional studies. In this study, we compared the expression stability of two widely used housekeeping genes, GAPDH and ACTB, in T. gondii–infected human foreskin fibroblasts. Immunocytochemistry and RT-qPCR revealed a discrepancy between protein and mRNA levels upon infection with a decrease in ACTB transcript levels at higher multiplicities of infection (MOI). Because this reduction might result from parasite-derived mRNA contributing to the total mRNA pool, the proportion of parasite transcripts was measured and found to constitute up to 30% of total mRNA at MOI 10. This indicates that T. gondii transcripts substantially contribute to total cDNA and can bias host gene quantification. After recalibrating RT-qPCR data to account for this contribution, ACTB expression remained stable across infection levels, whereas GAPDH showed moderate upregulation. These results demonstrate that ACTB serves as a more stable reference gene than GAPDH during T. gondii infection and emphasize the importance of accounting for pathogen-derived mRNA when interpreting host transcriptional data in eukaryotic intracellular infections.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Methods 4
• Results 10
• Discussion 20
• References 29
• Abstract in Korean 38