Investigation of circulating EV microbiome-derived RNA profile in before and after bariatric surgery = 비만수술 전, 후 순환 EV의 미생물군 유래 RNA 프로필 조사

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Obesity has become a major health burden and a key driver of chronic diseases. Bariatric surgery is an effective treatment for severe obesity and induces marked metabolic changes. The human body hosts trillions of microorganisms, and growing evidence links obesity to alterations in the human microbiota. Microbial extracellular vesicles (EVs) may play roles in host–microbiome communication by delivering RNA and other molecular cargos that could influence immunity and metabolism. Because bariatric surgery reshapes both host metabolism and gut microbiota, it offers a unique opportunity to examine shifts in microbial EV RNA composition. Yet, circulating microbiome-derived EV RNAs have not been studied in pre- and post-bariatric surgery patients.
Objective: This study aims to profile bariatric surgery–associated changes in the microbiome-derived RNA cargo of circulating extracellular vesicles(Cir-EVs) in obese patients. Therefore, we sought to examine changes in the abundance of human microbiome species before and after bariatric surgery using circulating EV RNAs, and to investigate the characteristics of Cir-EV RNA content to better elucidate the roles of circulating EVs.
Methods: Cir-EVs were first isolated from serum samples of each group (healthy control, pre-surgery, and post-surgery) using a PEG precipitation buffer, followed by RNA extraction and RNA sequencing. The resulting sequences were aligned to the Human Microbiome Reference Genome (HRGM/HROM) to identify the dominant microbial species. Among these species, E. coli was found to be relatively abundant, and thus the laboratory substrain E. coli DH5α was selected as a reference model to further characterize Cir-EV RNA features. To determine whether Cir-EV RNAs contain microbiome gene-derived sequences, additional analyses were performed using the NCBI BLAST database.
Results: Mapping Cir-EV RNAs to the human microbiome reference genome revealed changes in microbiome species abundance before and after bariatric surgery. Furthermore, BLAST analysis confirmed that Cir-EV RNAs contain known gene RNAs and unknown gene RNAs originating from human microbiome species.

국문 초록 (Abstract)

배경: 비만은 주요한 건강 부담이자 다양한 만성 질환의 발병을 촉진하는 핵심 요인으로 알려져 있습니다. 비만대사수술(bariatric surgery)은 중증 비만 환자에게 효과적인 치료법으로 활용되며, 수술 후 뚜렷한 대사적 변화를 유도합니다. 인체에는 수조 개의 미생물이 공생하고 있으며, 최근 연구들은 비만과 인간 마이크로바이옴 구성 변화 간의 연관성을 제시하고 있습니다. 특히 미생물 세포외 소포(microbial extracellular vesicles, EVs)는 RNA를 포함한 다양한 분자들을 전달함으로써 숙주–미생물 간 상호작용에 관여할 가능성이 제기되고 있습니다. 비만수술은 숙주 대사뿐만 아니라 장내 미생물군의 구성을 변화시키므로, 수술 전후의 미생물 EV RNA 조성을 비교할 수 있는 중요한 연구적 기회를 제공합니다. 그러나 현재까지 비만수술 전후 환자에서 순환 미생물 유래 EV RNA를 분석한 연구는 보고된 바 없습니다.
목적: 본 연구는 비만 환자의 비만수술 전후에서 순환 세포외 소포(circulating extracellular vesicles, Cir-EVs) 에 포함된 미생물 유래 RNA cargo의 변화를 규명하는 데 목적이 있습니다. 이를 위해 Cir-EV RNA를 기반으로 인간 마이크로바이옴 종들의 상대적 풍부도 변화를 분석하고, Cir-EV RNA의 구성적 특징을 파악함으로써 Cir-EV의 생물학적 의미를 보다 명확히 이해하고자 하였습니다.
방법: 건강 대조군, 수술 전, 수술 후 환자군에서 혈청을 채취하여 PEG 침전법으로 Cir-EV를 분리한 후, RNA를 추출하여 RNA 시퀀싱을 수행하였습니다. 생성된 RNA 서열은 Human Microbiome Reference Genome(HRGM/HROM)에 매핑하여 우세한 미생물 종을 확인하였습니다. 이 중 E. coli가 풍부한 종으로 나타나, 실험실 보유 균주인 E. coli DH5α를 모델로 선정하여 Cir-EV RNA의 특성 분석을 수행하였습니다. 또한 Cir-EV RNA가 실제 미생물 유래 gene 서열을 포함하는지 확인하기 위해 NCBI 웹사이트의 BLAST 분석을 추가적으로 실시하였습니다.
결과: Cir-EV RNA를 인간 마이크로바이옴 참고 유전체에 정렬한 결과, 비만수술 후에 마이크로바이옴 종들의 풍부도에 변화가 상대적으로 나타나는 것을 확인하였습니다. 또한 BLAST 분석을 통해 Cir-EV RNA가 인간 마이크로바이옴 종에서 유래한 알려진 유전자 RNA와 미지의 유전자 RNA를 모두 포함하고 있음을 검증하였습니다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT iv
• Introduction 1
• 1.1. Motivation and purpose of research 1
• Chapter 2: Scientific background 2
• 2.1. The severity of obesity in the modern population 2
• 2.2. Bariatric Surgery as an Effective Metabolic Treatment for Severe Obesity 2
• 2.3. Relationships between Human Microbiota and Obesity 2
• 2.4. Bacterial Extracellular Vesicle(BEV) 3
• 2.5. Composition and Functional Roles of Bacterial Extracellular Vesicle Cargo RNA 6
• Chapter 3: Changes in Microbiome Species Abundance After Bariatric Surgery Revealed by Circulating EV RNA 7
• 3.1. Introduction 7
• 3.2. Materials and Methods 8
• 3.2.1 Participants 8
• 3.2.2 Cir-EV and Cir-EV RNA isolation and analysis 8
• 3.2.3 Cir-EV RNA-seq data Preprocessing 9
• 3.2.4 Identification of Candidate Species from Cir-EV RNA-seq data 9
• 3.3. Results 9
• 3.3.1 Filtration of Cir-EV RNA reads to remove human origin 9
• 3.3.2 Mapping Cir-EV RNA to the Human Microbiome Genome 14
• 3.3.3 Cir-EV RNA Shows Abundant Microbial Species Across All Groups and Reveals Bariatric Surgery-Associated Expression Changes 17
• Chapter 4: Investigating the RNA carried by microbiome-derived EVs present in human circulatory system 22
• 4.1. Introduction 22
• 4.2. Materials and Methods 22
• 4.2.1 Growing Bacteria and obtaining bacterial extracellular vesicles(EVs) 22
• 4.2.2 Characterization of Bacterial Extracellular Vesicles 23
• 4.2.3 Isolation and assessment of RNA from DH5α whole cells and DH5α extracellular vesicles 23
• 4.2.4 Complementary DNA library preparation and RNA-seq 24
• 4.2.5 Alignment and Coverage Depth Calculation for Cir-EV RNA, DH5α whole cell RNA, and DH5α EV RNA 24
• 4.2.6 Statistical Analysis and Clustering 25
• 4.2.7 Aligned Region Annotation 25
• 4.2.8 BLAST-Based Confirmation of Gene Features in Annotated Co-aligned Sequences 26
• 4.3. Results 27
• 4.3.1 Preparation of Whole Cell and Extracellular Vesicle RNA Datasets from DH5α 27
• 4.3.2 RNA Sequencing and Composition of DH5α Whole Cell and EV RNA 30
• 4.3.3 Characterizing Circulating Microbiome-EV RNA and Validating Its Microbial Gene Origin 33
• Discussion 37
• Conclusion 39
• REFERENCES 40
• DECLARATIONS 44
• ABBREVIATIONS 45
• LIST OF FIGURES 46
• LIST OF TABLES 47
• ACKNOWLEDGEMENTS 50
• ACKNOWLEDGEMENTS 52