외과적으로 유발된 골관절염 랫트 모델에서 二仙湯의 개선 효과 = Ameliorating Effects of Yiseon-tang Water Extracts on the Surgical-induced Osteoarthritis in Rats

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

PURPOSE: The purpose of this study was to confirm dose-dependent ameliorating effects of water extracts of Yiseon-tang (YST) on osteoarthritis (OA) in rats surgical induced by anterior cruciate ligament transaction and partial medial meniscectomy.
METHODS: 48 rats were selected based on body weight and knee thickness, and allocated for six groups; sham control group, OA control group, diclofenac sodium 2 ㎎/㎏ group and three YST groups. The oral dose levels of YST were selected as 400, 200 and 100 ㎎/㎏. The administrations were applied once a day for 56 days. Knee thicknesses, maximum extension angle of each knee, bone mineral density(BMD) of the total knee joints, femur and tibia articular surface, compressive strength on the femur and tibia articular cartilage (AC) were measured to confirm gross morphological, funtional, physical changes. Mankin score and cell proliferation on the femur and tibia AC and synovial membrane (SM) were examined to confirm histopathological changes. Prostaglandin E2 level (PGE2), 5-lipoxygenase (LPO) activity, cleaved Poly(ADP-ribose) polymerase(PARP), Tumor necrosis factor(TNF-α) and Cyclooxygenase(COX)-2 immunoreactive cell numbers on the femur and tibia AC and SM were evaluated to confirm inflammatory changes and cell death. Matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 activities, 5-Bromo-2’-Deoxyuridine(BrdU) immunoreactive cell numbers, chondrogenic gene mRNA expressions in femur and tibia AC with SM were measured to confirm cartilage preservation and chondrocyte proliferation.
RESULTS: In the OA control group, an increase in knee thicknesses, maximum extension angle of each knee, PGE2, 5-LPO, MMP-2, MMP-9 activities, Mankin score, cleaved PARP, TNF-α and COX-2-immunoreactive cell numbers, and an decrease in BMD, mRNA expressions of collagen type II, SOX9 and aggrecan, BrdU-immunoreactive cell number was observed. Induced OA findings were significantly inhibited by subcutaneous treatment of diclofenac sodium 2 ㎎/㎏, and oral administration of YST 400, 200 and 100 ㎎/㎏. YST showed dose-dependent and favorable anti-OA activities with additional chondrocyte proliferating activities, which did not observed in diclofenac sodium treatment. YST 400 ㎎/㎏ oral administration were comparable with anti-OA activities and chondrocyte proliferating activities, to diclofenac sodium treatment.
CONCLUSION: YST could be used as an effective treatment for OA improvement through by anti-inflammatory, AC preserve and proliferating activities.

국문 초록 (Abstract)

실험목적: 본 연구는 전방 십자인대 및 내측 반월판 부분 절제술로 유발한 골관절염 랫트에 대하여 二仙湯 열수 추출물의 용량 의존적인 개선 효과를 확인하고자 시행하였다.
실험방법: 체중 및 무릎 두께를 기반으로 총 48 마리의 렛트를 선정하여 정상 대조군, 골관절염 대조군, 디클로페낙 나트륨 2 ㎎/㎏ 피하 투여군, 二仙湯 고용량, 중간용량, 저용량 경구 투여군 총 6개 그룹으로 할당하였다. 二仙湯의 경구 용량은 400, 200, 100 ㎎/㎏로 설정하였다. 각 약물은 총 56일간 1일 1회 투여하였다. 육안적 형태 및 기능적 변화를 확인하기 위해 각 무릎관절의 두께와 최대 신전 각도를 측정하였으며, 물리적 손상 정도를 확인하기 위해 전체 무릎관절과 대퇴골 및 경골의 골밀도, 대퇴골 및 경골의 관절연골 압축 강도를 측정하였다. 세포의 염증성 변화를 확인하기 위해 관절연골 및 활막의 PGE2, 5-LPO 활성도, 연골 보호 활성을 확인하기 위해 관절연골 및 활막 내 MMP-2, MMP-9를 측정하였다. 조직병리학적 변화를 확인하기 위해 대퇴골 및 경골의 관절연골의 관절연골과 활막의 세포 수 변화, 활막으로의 염증세포 침윤 수, Mankin score를 확인하였다. 연골세포 증식성을 확인하기 위해 연골 생성 염색체의 mRNA 발현, 관절연골 및 활막 내 BrdU 면역반응 세포 변화를 확인하였다. 세포 사멸을 확인하고자 관절연골 및 활막 내 cleaved PARP 면역반응 세포 변화를, 세포 내 염증 물질을 확인하고자 TNF-α, COX-2 면역반응 세포 변화를 확인하였다.
결과: 골관절염 대조군에서는 무릎 두께, 최대 신전 각도가 증가하였으며, PGE2, 5-LPO, MMP-2, MMP-9 활성 증가, Mankin score 증가, cleaved PARP, TNF-α, COX-2 면역반응 세포 증가 경향을 나타내었으며, 골밀도 감소, 2형 콜라겐, SOX9, aggrecan 등의 mRNA 발현 감소, BrdU 면역반응 세포의 감소를 확인하였다. 유발된 골관절염 증상 및 지표들은 디클로페낙 2 ㎎/㎏ 피하 투여 및 二仙湯 400, 200, 100 ㎎/㎏ 경구 투여로 유의하게 억제되었다. 二仙湯은 용량 의존적으로 항 골관절염 효과를 나타내었으며, 디클로페낙 치료에서 관찰되지 않은 추가적인 연골 증식 활성을 나타내었다. 二仙湯 400 ㎎/㎏ 경구 투여는 디클로페낙 치료와 유사한 항 골관절염 효과를 나타내었으며, 연골 증식 효과를 가지는 것으로 나타났다.
결론: 二仙湯은 항염증, 관절연골 보존 및 증식 활성을 통하여 골관절염을 개선하는 데 유효한 효과를 가지는 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 3
• 1. 실험동물 3
• 2. 약재 준비 및 투여 6
• 3. 골관절염 유도 8
• 4. 체중 측정 10
• 5. 무릎관절 두께 측정 10
• 6. 무릎관절의 최대 신전 각도 측정 11
• 7. 골밀도 측정 11
• 8. 압축 강도 측정 11
• 9. 대퇴골 및 경골의 관절연골 및 활막 조직 균질액 준비 12
• 10. PGE2 수치 분석 12
• 11. 5-LPO 활성 분석 12
• 12. MMP 억제 효능 분석 13
• 13. RT-PCR를 통한 ECM 관련 연골재생 유전자의 mRNA 발현 분석 13
• 14. BrdU 흡수 분석 16
• 15. 일반 조직학적 검사 16
• 16. 면역조직화학 검사 17
• 17. 조직형태계측 검사 19
• 18. 통계학적 분석 21
• Ⅲ. 결 과 22
• 1. 체중 및 증체량 변화 22
• 2. 무릎 두께 변화 25
• 3. 슬관절낭 노출 후 무릎 두께 변화 27
• 4. 무릎관절 최대 신전 각도 변화 29
• 5. 골밀도와 DEXA 이미지 변화 32
• 6. 대퇴골과 경골의 관절연골의 압축 강도 변화 35
• 7. PGE2 수치 변화 38
• 8. 5-LPO 활성 변화 40
• 9. MMP-2, MMP-9 활성 변화 42
• 10. ECM 관련 연골재생 유전자의 mRNA 발현 변화 45
• (1) 2형 콜라겐 mRNA 45
• (2) SOX9 mRNA 47
• (3) Aggrecan mRNA 49
• 11. 일반 조직학적 검사 변화 51
• (1) 대퇴골 관절연골 두께 변화 51
• (2) 경골 관절연골 두께 변화 51
• (3) 활막 상피세포 두께 변화 51
• (4) 활막으로의 염증세포 침윤 수 변화 52
• 12. Mankin scores 변화 55
• 13. BrdU 면역반응 세포 변화 58
• 14. cleaved PARP 면역반응 세포 수 변화 61
• 15. TNF-α 면역반응 세포 수 변화 64
• 16. COX-2 면역반응 세포 수 변화 67
• Ⅳ. 고 찰 70
• Ⅴ. 결 론 77
• 참고문헌 78
• 국문초록 83
• Abstract 85