HPLC-UV 및 LC/MS를 이용한 합성 산화방지제 8종의 다성분 동시분석법 확립 및 검증 = Establishment and Validation of a Simultaneous Determination Method for Eight Synthetic Antioxidants Using HPLC-UV and LC/MS

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 합성 산화방지제 (synthetic antioxidants, SAs) 8종 [2-tert-butyl-4-hydroxyanisole (2-BHA), 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole (3-BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), tert-butylhydroquinone (TBHQ), propyl gallate (PG), octyl gallate (OG), dodecyl gallate (DG), ethoxyquin (EQ)]의 고성능액체크로마토그래피-자외선검출기 (High Performance Liquid Chromatography-Ultraviolet Detector, HPLC-UV)와 단일사중극자 질량분석기 (Liquid Chromatography-Single Quadrupole Mass Spectrometry, LC/MS)를 동시분석법을 개발하고 이의 타당성을 검증하기 위해 수행되었다. 개발된 분석법은 직선성 (linearity), 검출한계 (limit of detection, LOD), 정량한계 (limit of quantification, LOQ), 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy) 산출을 통해 타당성이 검증되었다.
HPLC-UV 동시분석법 개발을 위해 이동상의 조성 (물, 아세토니트릴, 빙초산)을 조정하고, 다양한 컬럼 조건을 비교하여 최적의 분리능을 확보하였다. 개발된 동시분석법을 이용한 합성 산화방지제 8종의 표준 검량선 (standard curve) 결정계수 (R2)는 모두 0.99 이상으로 우수한 직선성을 나타내었다. 검출한계는 0.21–0.89 μg/mL, 정량한계는 0.63–2.69 μg/mL 범위로 나타났으며, 정확도와 정밀도는 일내분석에서 84.54–110.21% (RSD 0.01–1.71%)와 일간분석에서 84.02–104.54% (RSD 0.05–2.36%)로 확인되었다. 또한, 회수율 (recovery)의 경우 식용유 음성시료에 8종의 산화방지제를 스파이크 (spike)하여 분석한 결과, 합성 산화방지제 8종의 회수율은 80.66–109.41% (RSD 0.00–9.85%)로 나타났다.
LC/MS 동시분석법은 HPLC-UV 분석에서 사용한 이동상 조성을 참고하여, 물, 아세토니트릴 및 개미산의 비율을 조정하였으며, electrospray ionization (ESI)의 가스 온도, 유량, 그리고 nebulizer 압력을 단계적으로 조절하여 최적의 분석 조건을 확립하였다. 개발된 LC/MS 동시분석법의 표준 검량선 결정계수 (R²) 역시 모두 0.99 이상으로 우수한 직선성을 보였으며, 검출한계와 정량한계는 각각 0.01–1.33 μg/mL 및 0.03–4.02 μg/mL 범위로 확인되었다. 정확도와 정밀도는 일내분석에서 84.92–117.02% (RSD 0.28–14.96%), 일간분석에서 84.55–116.81% (RSD 0.00–11.27%)로 나타났다. 이상의 결과는 국제 표준화 기구에서 제시한 기준에 적합하였으며, 본 연구에서 개발한 합성 산화방지제 8종 동시분석법의 타당성이 확인되었다.
또한 본 연구에서 개발한 동시분석법의 실제 식품 적용 가능성을 검증하기 위해 국내외 시판 식품 중 합성 산화방지제를 사용한 식용유지류 5종을 분석한 결과, 모든 양성 시료에서 2종 이상의 합성 산화방지제가 동시에 검출되었다. HPLC-UV 정량 분석을 통해 확인된 함량은 모두 국내 및 국제 규격에 적합한 수준으로 나타나, 본 연구에서 개발한 시험법이 식품 내 합성 산화방지제의 신뢰성 있는 정량 분석에 적용 가능함을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was conducted to develop and validate simultaneous determination methods for eight synthetic antioxidants (SAs)—namely—2-tert-butyl-4-hydroxyanisole (2-BHA), 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole (3-BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), tert-butylhydroquinone (TBHQ), propyl gallate (PG), octyl gallate (OG), dodecyl gallate (DG), and ethoxyquin (EQ)—using high-performance liquid chromatography with ultraviolet detector (HPLC-UV) and liquid chromatography–single quadrupole mass spectrometry (LC/MS). The methods were validated by evaluating linearity, limits of detection (LOD), quantification (LOQ), precision, and accuracy. The mobile phase composition (water, acetonitrile, and acetic acid) and column conditions were optimized in the HPLC-UV method to achieve a satisfactory resolution of all the target analytes. The optimized method exhibited excellent linearity (R² ≥ 0.99), with LODs and LOQs of 0.21–0.89 μg/mL and 0.63–2.69 μg/mL, respectively. The intra-day accuracy and precision were 84.54–110.21% (RSD 0.01–1.71%), whereas the inter-day accuracy and precision were 84.02–104.54% (RSD 0.05–2.36%). Recovery experiments performed using antioxidant-free edible oil (blank matrix) spiked with the eight analytes resulted in recoveries of 80.66–109.41% (RSD 0.00–9.85%). For the LC/MS method, the mobile phase composition derived from the HPLC-UV method was further optimized by adjusting the ratio of water, acetonitrile, and formic acid, together with the systematic optimization of the electrospray ionization (ESI) parameters including gas temperature, gas flow rate, and nebulizer pressure. This method also demonstrated excellent linearity (R² ≥ 0.99), with LODs and LOQs of 0.01–1.33 μg/mL and 0.03–4.02 μg/mL, respectively. Intra-day and inter-day accuracy and precision were within 84.92–117.02% (RSD 0.28–14.96%) and 84.55–116.81% (RSD 0.00–11.27%), respectively. To evaluate their practical applicability, five commercially available edible oils containing SAs were analyzed. All the positive samples contained more than two antioxidants, and the quantified levels were within the domestic and international regulatory limits. These findings demonstrate that the proposed HPLC-UV and LC/MS methods are reliable and applicable for the quantitative determination of SAs in food matrices.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약ⅰ
• 목 차 ⅲ
• List of tables ⅴ
• List of figuresⅷ
• 제1장 서론 1
• 제2장 재료 및 방법7
• 1. 시약 및 시액 7
• 2. 분석 장비 및 기기 8
• 3. HPLC-UV 동시분석 조건 9
• 4. LC/MS 동시분석 조건 13
• 1) UPLC 분석 조건 13
• 2) MS 검출 조건13
• 5. 시료 전처리법 16
• 6. 최적 분석법 타당성 검증19
• 1) 직성성, 검출한계 및 정량한계19
• 2) 정밀도와 정확도 21
• 7. 개발된 분석법의 현장적용 22
• 제3장 결과 및 고찰
• 1. HPLC-UV 동시분석법의 확립 23
• 2. LC/MS 동시분석법의 확립 32
• 1) UPLC 분석 조건 확립32
• 2) MS 검출 조건 확립 35
• 3) LC/MS 동시분석법의 확립 40
• 3. 전처리법의 확립47
• 4. 최적 분석법 타당성 평가 51
• 1) 직성성, 검출한계 및 정량한계51
• 2) 정밀도와 정확도 60
• 5. 개발된 분석법의 현장적용 66
• 제4장 결론 72
• 제5장 참고문헌75
• Abstract81
• 감사의 글 83