단백질 침전, 액-액 추출 및 LC-scheduled MRM에 기반한 rat plasma 중 dexamethasone 분석법 개발 및 검증

국문 초록 (Abstract)

글루코코르티코이드(Glucocorticoids, GCs)는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 등 다양한 만성 염증성 질환의 치료에 임상적으로 널리 사용되고 있다. 이 중 대표적인 합성 글루코코르티코이드인 덱사메타손(dexamethasone, DEX)은 여러 종양 세포주 및 전임상 동물모델에서 항종양 효능이 보고되면서 항암 치료제로서의 잠재력이 제시되고 있다. 그러나 DEX의 장기간 또는 고용량 사용은 고혈압, 당뇨, 골다공증 및 부신 기능 저하 등 다양한 전신 부작용을 유발할 수 있어, 보다 안전하고 적정한 투여 전략의 확립이 요구된다. 이에 따라 DEX의 약물동태 평가 및 제제 개발을 위해서는 혈장 분석을 포함한 신뢰성 있는 생체 시료 분석법의 확보가 필수적이다. 본 연구에서는 rat 혈장에서 덱사메타손(DEX)을 정량 분석하기 위해 단백질 침전법(protein precipitation, PPT)과 액-액 추출법(liquid–liquid extraction, LLE)을 결합한 시료 전처리 방법을 개발하였다. 내부표준물법을 적용하기 위한 내부표준물질(internal standard, IS)로는 DEX와 물리화학적 특성이 유사한 트리암시놀론 아세토니드(triamcinolone acetonide, TA)를 사용하였다. 시료 전처리 과정에서는 단백질 침전법(protein precipitation, PPT)에 이소프로판올을 적용하였으며, 액–액 추출법(liquid–liquid extraction, LLE)에는 디에틸에터와 디클로로메탄을 6:4(v/v)로 혼합한 용매를 사용하였다. 또한 층 분리 효율을 향상시키기 위해 포화 염화칼륨 수용액을 첨가하였다. LC–MS/MS 분석을 통해 정량을 수행하였으며, 크로마토그래피 피크 개형 개선을 위해 C18 컬럼과 기울기 용리 조건을 적용하였다. 또한 scheduled multiple reaction monitoring (sMRM)을 활용하여 대상 화합물의 머무름시간 구간만을 선택적으로 모니터링함으로써 분석 효율을 높였다. 개발된 분석법은 FDA M10 가이드라인에 따라 선택성, 최저 정량한계(0.5 ng/mL), 직선성(0.5–1000 ng/mL), 정확성(93.28–114.27%), 정밀성(0.41–19.89%), 회수율(86.56–88.36%) 및 희석 타당성(87.51±3.87%)에 대해 검증되었으며, 모든 평가 항목에서 기준을 충족하였다. 생체 시료 효과(matrix effect, 25.49–137.94%)는 matrix-matched standard (MMS)를 적용하여 보정하였다. 최종적으로 본 분석법을 DEX 제제의 약동학 평가에 적용한 결과, 실제 생체 시료에서도 충분한 분석 신뢰성이 확보됨을 확인하였다. 본 연구에서 제시한 분석법은 rat 혈장 기반 DEX 제제 개발 및 염증성 질환 개선 연구를 위한 유용한 분석 도구로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 4
• 1. 시약 및 재료 4
• 2. 표준용액 제조 및 품질 관리 시료 준비 5
• 1) DEX 표준원액 및 실험용액 제조 5
• 2) TA 표준원액 및 실험용액 제조 5
• 3) 품질 관리 시료의 제조 5
• 3. 시료 전처리 방법 6
• 4. LC-MS/MS 분석방법 7
• 5. 분석법 검증 9
• 1) 선택성 9
• 2) 감도 9
• 3) 생체 시료 효과 9
• 4) 검량선 10
• 5) 정확성 및 정밀성 10
• 6) 회수율 11
• 7) 희석의 타당성 11
• 6. 분석법의 약동학 적용 12
• Ⅲ. 결과 및 고찰 13
• 1. 분석법 개발 13
• 1) 액체 크로마토그래피 및 질량분석기 조건 확립 13
• 2) 시료 전처리 조건 확립 17
• 2. 분석법 검증 21
• 1) 선택성 및 감도(Specificity and sensitivity) 21
• 2) 생체시료 효과(Matrix effect) 23
• 3) 검량선(Calibration curve) 23
• 4) 정확성 및 정밀성(Accuracy and precision) 25
• 5) 회수율(Recovery) 25
• 6) 희석의 타당성(Dilution integrity) 25
• 3. 기존 분석법과의 비교 27
• 4. 검증된 분석법의 약동학 적용 29
• IV. 결론 32
• 참고문헌 33
• 영문초록 37